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文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

高齡是心血管疾病（CVD）發(fā)生的關(guān)鍵因素。此外，血管老化是導(dǎo)致CVD高死亡率的最重要的危險(xiǎn)因素之一，它影響CVD的閾值、發(fā)生過程和嚴(yán)重程度。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞衰老影響著血管老化。血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）是血管壁的重要組成部分，對維持心血管穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。因此，揭示EC衰老和血管老化的機(jī)制可能為防止血管疾病提供重要的治療策略。

目前已發(fā)現(xiàn)多種誘發(fā)EC衰老的因素，包括DNA損傷、端�？s短、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等。然而，ECs抵抗各種因素誘導(dǎo)衰老并在環(huán)境刺激后維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的機(jī)制仍然是一個(gè)有待研究的課題。

腸道菌群的代謝產(chǎn)物與CVD的發(fā)展之間存在重要關(guān)聯(lián)。有研究表明，細(xì)菌衍生的代謝產(chǎn)物可以影響宿主的壽命。越來越多的證據(jù)表明，氧化三甲胺（TMAO）是一種微生物依賴的代謝產(chǎn)物，可導(dǎo)致各種CVD發(fā)生，如動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭、中風(fēng)和高血壓。此外，TMAO已被證明與1型和2型糖尿病，慢性腎病和阿爾茨海默病有關(guān)。最近的研究表明，隨著年齡的增長，大鼠血漿中氧化三甲胺的水平會(huì)增加。然而，TMAO含量的升高是否與EC衰老及血管老化有關(guān)仍不清楚。

2018年1月，來自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部的鄭樂民研究組和福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院的洪華山研究組在《Free Radical Biology and Medicine》雜志（IF＝5．657，醫(yī)學(xué)二區(qū)）發(fā)表了題為“Gut flora－dependent metabolite Trimethylamine－N－oxide accelerates endothelial cell senescence and vascular aging through oxidative stress”的文章。

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所用到的主要方法

METHODS

1．等離子體分析：在禁食12 h后，將血樣收集到EDTA抗凝血管中。樣品立即以3000 g離心15 min，血漿保存于－ 80℃，解凍次數(shù)小于3次。

利用全自動(dòng)生化分析儀，對健康人群空腹血糖（FBG）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、肌酐和尿素進(jìn)行分析。

用穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC／MS／MS）對TMAO水平進(jìn)行定量。將20μL樣品添加到含有80μL的內(nèi)標(biāo)混合物（甲醇中含10μM d9－TMAO）的1．5mL離心管中。短暫混合后，將混合物在4－8℃下旋轉(zhuǎn)1min，并在－80℃下孵育4h以沉淀蛋白質(zhì)。在4℃，20000g離心10min后，回收上清液。為了獲得精確的TMAO濃度，用相同的程序處理20μL各種濃度標(biāo)準(zhǔn)物（0－100μM），當(dāng)測定系數(shù)（R2）達(dá)到0．999時(shí)，得到了標(biāo)準(zhǔn)曲線。上清液（70μL）以0．4 mL／min的流速用LC－20 CE島津泵系統(tǒng)注入硅膠柱，并用一臺(tái)SIL－20AXR自動(dòng)進(jìn)樣器連接到API 5500Q捕集器質(zhì)譜儀。將溶劑A（水中0．1％丙酸）與溶劑B（甲醇中0．1％乙酸）以不同的比例混合，從2％B開始，經(jīng)5min線性過渡到95％B，然后保持1min，然后還原到2％B，生成不連續(xù)的梯度來分解分析物。采用正離子電噴霧電離，分別在m／z 76→58、d9 －TMAO和m／z 85→66的條件下，對前驅(qū)體進(jìn)行多重反應(yīng)監(jiān)測，并對TMAO的特征產(chǎn)物轉(zhuǎn)變進(jìn)行監(jiān)測。

2．β－半乳糖苷酶（SA－β－gal）染色

3．組織病理學(xué)檢查

4．免疫組織化學(xué)染色法

5．血管功能評估

6．qRT－PCR

7．Western Blotting

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

腸道菌群依賴性代謝產(chǎn)物氧化三甲胺，已被證實(shí)與心血管疾病有關(guān)。然而，目前對TMAO與血管老化之間的關(guān)系知之甚少。對此，本文觀察了衰老過程中TMAO的變化以及TMAO對血管老化和內(nèi)皮細(xì)胞（EC）衰老的影響。同時(shí)分析了年輕人（18－44歲）、老年人（≥65歲）和1個(gè)月大、3個(gè)月大、6個(gè)月大和10個(gè)月大的快速老化小鼠（SAMP8）及抗快速老化小鼠（SAMR1）血漿中TMAO的水平。本文發(fā)現(xiàn)在人和小鼠體內(nèi)循環(huán)的TMAO水平隨著年齡的增長而增加。在TMAO處理小鼠16周后，通過上調(diào)衰老標(biāo)志物（包括衰老相關(guān)β－半乳糖苷酶（SA－β－Gal）、p53和p21）、及促進(jìn)血管功能障礙和重塑，誘導(dǎo)SAMR1小鼠的血管老化，加速SAMP8小鼠的衰老過程。在體外，TMAO的長期處理可誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）衰老，表現(xiàn)為減少細(xì)胞增殖，增加衰老標(biāo)記物的表達(dá)，G0／G1停滯，抑制細(xì)胞遷移。此外，TMAO抑制了去乙酰化酶 1（SIRT1）的表達(dá)，增加了體內(nèi)和體外的氧化應(yīng)激，激活p53／p21／Rb途徑，導(dǎo)致p53、p23、p21的乙�；�，并降低了CDK2、cyclinE1和Rb的磷酸化。結(jié)果表明：衰老過程中循環(huán)TMAO的升高可能會(huì)惡化EC衰老和血管老化，這可能與抑制SIRT1的表達(dá)和氧化應(yīng)激的增加有關(guān)，從而激活p53／p21／Rb通路。

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相關(guān)鏈接

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Cell：內(nèi)皮細(xì)胞中NAD＋／H2S信號(hào)受損是血管老化的可逆性原因