疫苗是預防傳染性疾病傳播的最有效的公共衛(wèi)生干預措施。成功的疫苗接種根除了許多威脅生命的疾病，如天花和脊髓灰質炎，世界衛(wèi)生組織估計疫苗每年可防止200－300萬人死于破傷風、百日咳、流感和麻疹。然而，盡管常規(guī)疫苗取得了明顯的成功，但它們并不能有效對付瘧原蟲、丙型肝炎和HIV等逃避免疫監(jiān)視的病原體。此外，它們需要定期修改以應對快速變異的病原體，如流感病毒。

基于mRNA的核酸疫苗是在30多年前提出的，希望能產生安全、多功能、易于生產的疫苗。mRNA疫苗比傳統(tǒng)疫苗有許多優(yōu)點：與某些病毒疫苗不同，mRNA不會整合到基因組中，從而避免了對插入突變的擔憂；mRNA疫苗可以以無細胞的方式制造，從而實現(xiàn)快速、經(jīng)濟、高效的生產。此外，單個mRNA疫苗可以編碼多種抗原，增強針對適應性病原體的免疫反應，并能夠以單一配方針對多種微生物或病毒變體。

最初，由于擔心其穩(wěn)定性、低效性和過度免疫刺激，mRNA治療并沒有得到重視。然而在過去的十年中，mRNA治療領域日新月異，包括mRNA藥理學的深入研究，有效載體的開發(fā)和mRNA免疫原性的控制，使得mRNA疫苗的臨床應用進入了一個嶄新的階段。

mRNA的設計與合成

體外轉錄（IVT）mRNA模擬內源性mRNA的結構，有五個部分，從5?到3?包括：5?cap，5?非翻譯區(qū)（UTR），一個編碼抗原的開放閱讀框，3?UTR和一個PolyA尾。

與天然真核mRNAs一樣，5′端帽結構包含一個7－甲基鳥苷核苷，5′端結構會在空間上保護mRNA不被核酸外切酶降解，并與翻譯起始因子蛋白協(xié)同工作，招募核糖體以啟動翻譯。PolyA尾的長度間接調節(jié)mRNA翻譯和半衰期。

編碼區(qū)兩側的5′和3′UTR調節(jié)mRNA翻譯、半衰期和亞細胞定位，來自高表達基因（如α－和β－珠蛋白基因）的天然UTR是合成mRNAs的首選。此外，UTR可根據(jù)細胞類型進行優(yōu)化，如通過去除3′UTR中的miRNA結合位點和富含AU的區(qū)域，將mRNA降解降至最低。

mRNA疫苗的開放閱讀框是最關鍵的組成部分，盡管開放閱讀框不像非編碼區(qū)那樣具有可塑性，但可以通過優(yōu)化密碼子，從而在不改變蛋白質序列的情況下增加翻譯。例如，CureVac AG公司發(fā)現(xiàn)人類mRNA密碼子很少在第三位有A或U，從而用G或C替換開放閱讀框第三位的A或U。并將此優(yōu)化策略用于其SARS－CoV－2疫苗CVnCoV，目前正處于III期試驗階段。

為了最大化翻譯，mRNA序列通常包含修飾的核苷，例如假尿苷、N1－甲基假尿苷或其他核苷類似物。修飾核苷的使用，特別是修飾尿苷，阻止了模式識別受體的識別，保證了翻譯過程產生足夠水平的蛋白質。Moderna和Pfizer–BioNTech SARS－CoV－2疫苗都含有核苷修飾。另一種避免模式識別受體檢測的策略，由CureVac首創(chuàng)，使用序列工程化和密碼子優(yōu)化，通過提高疫苗mRNA的GC含量來消耗尿苷。

除了mRNA序列的改進外，在簡化mRNA生產方面也取得了重大進展。臨床上使用的合成mRNA通過使用噬菌體RNA聚合酶T7（也可以使用T3和SP6聚合酶）從DNA質粒在體外轉錄。另外，使用CleanCap的共轉錄封蓋技術，簡化了純化步驟。

mRNA疫苗的載體

由于mRNA較大（104–106Da）且?guī)ж撾�，因此無法通過細胞膜的陰離子脂質雙層。此外，在體內，它會被先天免疫系統(tǒng)的細胞吞噬，并被核酸酶降解。因此，體內應用需要使用mRNA遞送載體，該載體轉染免疫細胞而不會引起毒性或不必要的免疫原性。目前，已經(jīng)為此開發(fā)了許多基于創(chuàng)新材料的解決方案。

脂質納米顆粒（LNP）

脂質納米顆粒是臨床上最先進的mRNA載體。截至2021年6月，所有正在研制或批準臨床使用的SARS－CoV－2 mRNA疫苗均采用LNPs。LNP為mRNA遞送提供了許多好處，包括制劑簡單、模塊化、生物相容性和較大的mRNA有效載荷容量。除RNA藥物外，LNP通常包括四種成分，可電離脂質、膽固醇、輔助磷脂和聚乙二醇化脂質，它們共同封裝和保護脆弱的mRNA。

可電離脂質與mRNA在酸性緩沖液中形成納米顆粒，使脂質帶正電荷并吸引RNA。此外，它們在內涵體的酸性環(huán)境中帶正電荷，這促進了它們與內涵體膜的融合，將其釋放到細胞質中。

DODAP和DODMA是第一種用于RNA輸送的可電離脂質。通過設計提高DODMA的功效，產生了DLin－MC3－DMA。這是第一個FDA批準的藥物制劑中使用的可電離脂質：siRNA藥物patisiran（Onpattro）。除了有效且安全地遞送siRNA外，DLin－MC3－DMA還用于mRNA的遞送。

目前，學術界和工業(yè)界的許多團體使用組合反應方案來合成潛在的傳遞材料，這種方法產生了許多有效的脂質，包括C12－200、503O13、306Oi10、OF－02、TT3、5A2－SC8、SM－102（用于抗SARS－CoV－2的Moderna疫苗mRNA－1273）和ALC－0315（用于輝瑞疫苗BNT162b2）。

除了尋求提高療效外，人們越來越關注提高藥物的特異性，特別是對疫苗和免疫療法的特異性。含有多環(huán)金剛烷尾的脂質11－A－M58，和含有環(huán)咪唑頭的脂質93－O17S59，已被設計用于體內靶向T細胞。盡管機制尚不清楚，但這些脂質的環(huán)狀基團對于靶向T細胞至關重要。

盡管電離脂質可以說是LNP最重要的成分，但其他三種脂質成分（膽固醇、輔助脂質和聚乙二醇化脂質）也促進了納米粒子的形成和功能。膽固醇是一種天然存在的脂質，它通過填充脂質之間的空隙來增強納米顆粒的穩(wěn)定性，并有助于在攝取到細胞的過程中與內涵體膜融合。

輔助脂質通過促進有助于膜與內涵體融合的脂質相變來調節(jié)納米顆粒的流動性并增強功效。最佳輔助脂質的選擇取決于可電離脂質材料和RNA載體。例如，對于類脂質材料，飽和輔助脂質（如DSPC）最適合傳遞短RNA（如siRNA），而不飽和脂質（如DOPE）最適合傳遞mRNA 。DSPC已被用于FDA批準的SARS－CoV－2疫苗mRNA－1273和BNT162b2中。

LNPs的聚乙二醇化脂質成分由聚乙二醇（PEG）與錨定脂質（如DMPE或DMG）結合而成。親水性PEG可以穩(wěn)定LNP，通過限制脂質融合調節(jié)納米顆粒大小，并通過減少與巨噬細胞的非特異性相互作用增加納米顆粒半衰期。mRNA－1273和BNT162b2 SARS－CoV－2疫苗均含有聚乙二醇化脂質。

聚合物和聚合物納米顆粒

盡管臨床進展不如LNP，但聚合物具有與脂質相似的優(yōu)勢，能夠有效傳遞mRNA。陽離子聚合物將核酸濃縮成具有不同形狀和大小的復合物，可通過內吞作用進入細胞。

聚乙烯亞胺是研究最廣泛的核酸傳遞聚合物。盡管其功效卓越，但由于其高電荷密度，其毒性限制了應用。此外，已經(jīng)開發(fā)出幾種毒性較小的可生物降解聚合物。例如，聚（β－氨基酯）在mRNA傳遞方面表現(xiàn)出色，尤其是對肺。

最近開發(fā)出了一種新型的含脂聚合物，稱為電荷改變可釋放轉運體（CARTs），它能有效地靶向T細胞，操縱T細胞是非常困難的，因此，CART 是一種極具吸引力的傳遞材料，在mRNA疫苗和基因治療領域具有巨大潛力。

其他遞送系統(tǒng)

除了脂質和聚合物載體外，肽也可以將mRNA傳遞到細胞中，這要歸功于其主鏈和側鏈中的陽離子或兩親胺基（例如精氨酸），這些陽離子或兩親胺基與mRNA靜電結合并形成納米復合物。例如，含有重復的精氨酸－丙氨酸－亮氨酸－丙氨酸（RALA）基序的膜融合細胞穿透肽。

富含精氨酸的魚精蛋白肽在中性pH下帶正電荷，也可以濃縮mRNA并促進其傳遞。魚精蛋白與mRNA復合物激活識別單鏈mRNA的Toll樣受體（TLR7，TLR8）通路，因此，它還可以作為疫苗或免疫治療應用的佐劑。CureVac AG正在評估一種含有魚精蛋白的遞送平臺RNActive，用于黑色素瘤、前列腺癌和非小細胞肺癌的臨床試驗。

最后，基于角鯊烯陽離子納米乳液也可以傳遞mRNA，這些納米乳劑由油性角鯊烯核組成。一些角鯊烯制劑，如諾華的MF59，在FDA批準的流感疫苗中用作佐劑。MF59使注射部位的細胞分泌趨化因子，從而招募抗原呈遞細胞，誘導單核細胞分化為樹突狀細胞，并增強抗原呈遞細胞對抗原的攝取。角鯊烯基陽離子納米乳劑從內涵體逃逸并將mRNA輸送到細胞質中的機制尚不清楚。

mRNA疫苗技術創(chuàng)新

mRNA疫苗技術最重要的創(chuàng)新在于：mRNA 序列設計；開發(fā)簡單、快速和大規(guī)模生產 mRNA 的方法；開發(fā)高效、安全的 mRNA 疫苗遞送材料。

最近的一項研究使用了一種基于細胞培養(yǎng)的系統(tǒng)選擇過程來識別新的UTRs，它顯著增加了IVT mRNA的蛋白質表達。與人類β－珠蛋白3’UTR的相比，這些序列可以誘導相關轉錄物產生大約3倍的蛋白質。

此外，最近報道了一種有趣的新疫苗形式，該方法利用編碼α病毒RNA依賴性RNA聚合酶的mRNA加上編碼抗原的第二個mRNA，使其在細胞質中能夠復制。這種系統(tǒng)可以在非常低的劑量（50ng）就有效地誘導小鼠的保護性免疫反應。這些發(fā)現(xiàn)特別有吸引力，因為低劑量的使用降低了疫苗生產的成本。無遞送材料進一步降低了成本，簡化了制造，并且提高了疫苗凍干和在環(huán)境溫度下儲存的可能性。

在生產方面，除了cleancap技術外，最近開發(fā)了一種通過將雙鏈RNA污染物吸附到纖維素（一種廉價且豐富的多糖）來純化mRNA的簡單方法。研究證明，這種高度可擴展且廉價的方法與高效液相色譜法一樣有效地去除IVT mRNA樣本中的dsRNA污染物。

在遞送材料方面，與基于聚合物的CART平臺類似，mRNA－LNPs也實現(xiàn)了選擇性T細胞靶向。一種新的平臺，稱為ASSET（錨定二級靶向單鏈抗體），其中T細胞特異性單克隆抗體與LNP相連，以靶向T細胞。這種靈活的平臺在mRNA疫苗和其他應用方面也有很大的潛力。

另外一種脂質復合物在全身給藥后優(yōu)先靶向樹突狀細胞。用mRNA疫苗選擇性靶向DC以誘導強烈的免疫反應是一個潛在的關鍵發(fā)現(xiàn)，該平臺已經(jīng)在臨床試驗中證明了其前景。

小結

過去幾年在mRNA疫苗領域取得了極其重要的進展，并為這種新型疫苗模式的可行性提供了證據(jù)。新的制造方法和遞送材料將有助于快速、廉價地大規(guī)模生產下一代mRNA疫苗。同樣還有許多地方需要深入研究，以及更全面地了解各種mRNA疫苗類型的作用機制，以進一步地優(yōu)化mRNA疫苗技術。

參考文獻：

1． mRNA vaccines forinfectious diseases： principles， delivery and clinical translation． Nat RevDrug Discov． 2021 Aug 25 ： 1–22．

2． Recent advances in mRNA vaccine technology． Curr Opin Immunol． 2020 Aug；65：14－20．