近年來，自然殺傷（NK）細胞的CAR工程化由于NK細胞獨特的生物學特性而獲得了相當大的發(fā)展，使其成為腫瘤免疫治療中極具吸引力的領域。NK細胞，即使通過基因工程表達CAR分子，仍保留其通過自身受體識別腫瘤細胞的內在能力，此外NK細胞不依賴T細胞受體（TCR）進行細胞毒性殺傷。這使它們與CAR－T細胞相比具有更有利的安全性。

在過去幾年中，關于CAR－NK細胞產品的臨床研究出現(xiàn)了前所未有的加速。在整個試驗過程中，研究人員使用不同來源的NK細胞和各種模塊化的CAR設計，針對多種靶抗原�？偟膩碚f，有兩個主要趨勢：首先目標疾病的范圍發(fā)生了變化，雖然早期的大多數試驗集中于血液系統(tǒng)惡性腫瘤，但最近許多的試驗開始尋求探索CAR－NK細胞免疫療法在治療實體瘤方面的功效。第二，越來越多CAR－NK通過多重基因編輯方法去實現(xiàn)更復雜的結構設計，以增強NK細胞的效力和持久性，新一代的CAR－NK已暫露雛形。

更合理的結構設計

除了將CAR－NK細胞重新定向到不同的靶抗原外，最近的研究重點已越來越轉向基于不同跨膜和細胞內共刺激域的模塊化組合的優(yōu)化結構設計，以增強CAR－NK的效力。

如今，研究人員利用現(xiàn)有的多種基因工程能力，對CAR結構進行微調，以誘導更有效的抗腫瘤反應，增加抗原親和力或延長體內持久性。已經研究了多種共刺激元件，包括來源于免疫球蛋白超家族（CD28、ICOS）、TNF受體超家族（4－1BB、CD27、OX40和CD40）以及其他包括CD40L和toll樣受體（TLR）的結構域。與一些早期主要基于參與T細胞活化的共刺激結構域的CAR－NK結構相比，NK細胞特異性信號適配器的價值越來越高，DAP10、DAP12和2B4的作用尤為突出。

在一項研究CD19導向的CAR－NK的臨床前研究中，加入DAP10（NKG2D的生理適配器）比單獨使用CD3ζ信號的構建物增強了抗腫瘤效力。類似的，在其它研究中報道了通過將DAP12加入前列腺干細胞抗原（PSCA）靶向的CAR結構，以及將2B4加入間皮素靶向的CAR－NK細胞，結果均具有放大的抗腫瘤效力。

武裝CAR

前三代CAR結構設計的調整均依賴于生理上發(fā)生的免疫細胞受體結構域。而被稱為武裝CAR的第四代結構采用了一種截然不同的方法，通過加入分子有效載荷，從而賦予CAR修飾的免疫細胞在任何生理免疫細胞受體中都找不到的額外特征和功能。這種方法使CAR結構能夠被工程化，以解決細胞免疫治療的一些固有生物學局限。                      

借助現(xiàn)代雙順反子和多順反子載體平臺，第四代CAR結構可以包含多個理想的基因修飾。目前最緊迫的生物學限制是在缺乏外源性細胞因子支持的情況下，體內持久性的問題。通過添加結構性轉基因IL－15細胞因子，可以保持CAR－NK在體內的持續(xù)存在并增強抗腫瘤療效。另外，通過添加可誘導的半胱天冬酶9（iCasp9）的分子安全開關，可以清除所有循環(huán)中的過繼NK細胞，以防出現(xiàn)不良毒性。

CAR－NK免疫檢查點的修飾

盡管過繼性NK細胞治療取得了顯著的成功，但免疫細胞耗竭仍然是一個治療障礙。為了構建下一代的CAR－NK，NK細胞基礎生物學也正在努力，以確定NK細胞免疫功能的負調節(jié)因子。已經發(fā)現(xiàn)一些檢查點受體如PD－1、LAG－3、TIM－3、TIGIT以及KLRG1在耗竭的NK細胞中表達上調。

NKG2A是最顯著的抑制性NK細胞受體之一，它的基因缺失與NK細胞針對腫瘤的細胞毒性增加有關，阻斷TIGIT也被證明可以防止NK細胞耗竭。此外，通過添加含細胞因子可誘導SH2蛋白（CIS），這是IL－15信號上游的一個關鍵細胞因子檢查點，在CAR－NK細胞中實現(xiàn)了增強的代謝適應度和效應器功能。其他研究還包括PD－1／PD－L1和CTLA－4阻斷對NK細胞的影響。

促進CAR－NK細胞的靶向性

為了實現(xiàn)更好的抗實體瘤效果，下一代CAR－NK需要進行工程設計，以增強向腫瘤的遷移和穿透能力。一些研究正在加強NK細胞趨化因子受體的基因修飾，以使NK更有效地歸巢到腫瘤部位。在腎細胞癌中，經修飾表達CXCR2的NK細胞表現(xiàn)出向疾病部位轉運的改善。類似地，在EGFRvIII靶向的CAR－NK細胞上強制表達CXCR4可提高膠質母細胞瘤動物模型的存活率。

實體瘤的特點是具有高度的異質性，每個克隆都有其獨特的免疫表型和抗原表達模式，單一抗原導向的細胞療法往往面臨巨大障礙，雙特異性和多特異性靶向已經成為解決異質性帶來挑戰(zhàn)的一個有前途的方向。

一些研究已經在探索雙靶點CAR－NK的應用，如對野生型EGFR和EGFRvIII都具有特異性的NK－92衍生的CAR－NK細胞。當異種移植模型中，雙靶向CAR－NK細胞有效地抑制了腫瘤生長，提高了生存率，而與EGRF突變狀態(tài)無關。另外，一種多特異性B7－H3靶向iPSC衍生的CAR－NK可識別多種實體瘤。

改善免疫抑制腫瘤微環(huán)境

除了NK固有免疫檢查點外，還有一些由腫瘤微環(huán)境引起的外在因素，為浸潤免疫細胞創(chuàng)造了非常不利的環(huán)境。這些因素包括營養(yǎng)缺乏、酸度和缺氧的綜合作用，以及免疫抑制細胞和免疫抑制因子的影響。

免疫抑制代謝物腺苷已知通過阻斷NK細胞表面A2A腺苷受體（A2AR）影響NK細胞功能。A2AR敲除的NK細胞在BRAF突變黑色素瘤的異種移植小鼠模型中顯示出增強的腫瘤控制作用。此外，通過使用CRISPR／Cas9靶向編輯TGFBR2基因，成功地使原代人類NK細胞對免疫抑制性轉化生長因子β（TGF－β）產生拮抗。

調節(jié)CAR－NK代謝

目前，針對免疫代謝途徑已成為一個有趣的概念，以使NK細胞更具代謝活力并保持其功能能力。在NK細胞中，IFN－γ的產生依賴于葡萄糖驅動的氧化磷酸化。一旦激活，NK細胞就會發(fā)生實質性的代謝變化，從而增加糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）的速率，以支持產生有效免疫反應所需的能量。

雷帕霉素復合物1 （mTORC1）在調節(jié)NK細胞代謝中起著關鍵作用，研究表明，CISH信號的破壞產生對CAR－NK細胞的代謝重組，從而保持升高的mTORC1和MYC活性，促進體內持久性和增強抗腫瘤活性。

在轉錄水平上，甾醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBP）和MYC已被確定為協(xié)調代謝適應的兩個中央調節(jié)元件，使活化的NK細胞能夠有效地啟動免疫應答。MYC信號通過上調葡萄糖轉運蛋白和糖酵解酶的表達以及增加有絲分裂，使代謝機制適應NK細胞的特定需求。NK細胞中維持細胞內MYC蛋白水平的一種機制是通過糖原合成酶激酶3（GSK3）介導的磷酸化以及隨后的泛素化和蛋白酶體降解，研究發(fā)現(xiàn)，GSK3的抑制可穩(wěn)定NK細胞中的MYC水平，從而提高其抗腫瘤效力。

小結

許多利用高度創(chuàng)新的下一代基因工程方法的CAR－NK細胞療法正在探索中，以應對實體瘤的獨特挑戰(zhàn)，它們有望在短期內進入臨床試驗。支持這些發(fā)展的是對基礎免疫細胞生物學的日益增長的理解，強大的多功能組學和單細胞分析技術越來越多地推動了我們在這方面的認識。隨著基因工程能力的強大進步，這些見解將推動進一步的治療創(chuàng)新，并隨著時間的推移，從根本上改變當前的治療模式，顯著改善臨床結果，造福于更多的癌癥患者。

參考文獻：

1．Engineering the next generation of CAR－NKimmunotherapies． Int J Hematol． 2021 Aug 28 ： 1–18．