前言

blinatumomab在治療復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細胞白血病方面的成功，使基于雙特異性抗體的T細胞導(dǎo)向療法成為腫瘤免疫治療藥物開發(fā)的熱點。

這種分子結(jié)構(gòu)是通過與T細胞上的CD3和癌細胞上的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）的相互作用來連接T細胞和腫瘤細胞。通過繞過MHC／TCR識別，這種方法能夠在沒有克隆限制的情況下誘導(dǎo)T細胞活化，并克服因為MHC表達下調(diào)產(chǎn)生的腫瘤免疫逃逸。

近年來，隨著雙抗表達和純化技術(shù)的不斷突破，雙抗已經(jīng)發(fā)展出近70種結(jié)構(gòu)，而不同的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的抗原識別臂距離。鑒于幾何構(gòu)型可能在形成免疫突觸中起關(guān)鍵作用，通過構(gòu)建兩種不同形式的雙特異性抗體模式：diabody FC（DbFc）和基于IgG的分子模式，研究發(fā)現(xiàn)擁有更長結(jié)合臂的IgG分子結(jié)構(gòu)對膜近端的抗原表位更有效，而擁有較短結(jié)合臂的DbFc對對膜遠端的抗原表位更有效。

雙抗形式取決于作用目的

隨著重組蛋白表達技術(shù)和抗體工程技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了許多不同的抗體形式。最佳的抗體結(jié)構(gòu)取決于所期望的生物效應(yīng)及其潛在的結(jié)構(gòu)條件。多特異性抗體用于各種目的，包括受體激活、阻斷、內(nèi)化、聚集、膜相關(guān)蛋白的結(jié)合或細胞毒性效應(yīng)細胞的定向靶點。

人工免疫突觸的結(jié)構(gòu)特征

抗原呈遞細胞（APC）與T細胞之間的生理免疫突觸（IS）是T細胞活化的關(guān)鍵。在T細胞膜上，IS顯示為一個嵌套的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，常被稱為“bullseye”。中心區(qū)cSMAC（中央超分子激活簇）包含諸如T細胞受體（TCR）復(fù)合物、共刺激分子CD28、抑制免疫檢查點（如PD－1或CTLA－4）、信號介質(zhì)如Lck（淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶）和PKC（蛋白激酶C），以及穿孔素等細胞毒性分子。

cSMAC被周圍的SMAC（pSMAC）包圍，其中包含許多粘附分子，它們介導(dǎo)細胞－細胞的結(jié)合（如LFA1）。遠端環(huán)（dSMAC）包括抑制性酪氨酸磷酸酶CD45和動態(tài)肌動蛋白。APC和T細胞之間的膜距離約為13–15nm。試驗表明，一個拉長的膜間距降低了T細胞的活化，說明較近的距離是必須的，以適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)T細胞活化。眾所周知，BsAb通過同時結(jié)合靶細胞上的TCR亞單位CD3ε和TAA來促進規(guī)則的細胞溶解免疫突觸的形成。人工免疫突觸是一個高度組織化的結(jié)構(gòu)，與生理拓撲結(jié)構(gòu)具有相同的特征。腫瘤和T細胞之間的膜間距非常重要，因此，抗體尺寸是突觸形成的一個關(guān)鍵參數(shù)。短結(jié)合臂對膜遠端抗原更有效

為了比較不同雙抗形式的結(jié)合臂與形成人工免疫突觸誘導(dǎo)T細胞活化能力之間的關(guān)系，實驗人員設(shè)計了一種新的雙特異性diabody Fc（DbFc）格式，它采用了更緊湊的構(gòu)型。與的基于IgG的分子形式相比，兩個抗原識別臂之間的距離估計分別為3–6 nm和9–15 nm。

此外，為了系統(tǒng)地研究抗原表位位置在T細胞導(dǎo)向療法中的作用，實驗人員通過將表皮生長因子（EGF）樣結(jié)構(gòu)域作為相對剛性的結(jié)構(gòu)間隔物，設(shè)計了一系列表達BCMA抗原的細胞系，這些細胞系以不同的EGF樣結(jié)構(gòu)域作為系鏈，以增加到靶細胞膜的距離。

研究發(fā)現(xiàn)，在24小時的效應(yīng)器靶標比（E：T比）為5：1時，所有三種分子在誘導(dǎo)T0細胞系裂解方面表現(xiàn)出幾乎相等的活性，T0細胞系在細胞表面呈現(xiàn)BCMA而沒有任何栓系。隨著到細胞表面的距離隨著EGF樣結(jié)構(gòu)域數(shù)量的增加而增加，雙特異性IgG2誘導(dǎo)T細胞定向裂解的能力迅速減弱，而Db和DbFc在細胞系T0到T5中顯示出相當(dāng)強的細胞毒性，T6和T7中的效力顯著降低。

這說明雙特異性抗體分子使T細胞與靶細胞接近的程度對免疫突觸形成的效率有重要影響。全長IgG和Db衍生分子的差異可以用兩個抗原結(jié)合位點的臂距來解釋，因為Db和DbFc結(jié)構(gòu)更為堅硬和緊湊，導(dǎo)致T細胞和抗原表達細胞之間的距離相對較短，當(dāng)超過T細胞活化的距離閾值時，雙抗的殺傷功能就會明顯下降。

長結(jié)合臂對膜近端抗原更有效

然后實驗人員檢查了相反的情況，抗原表位位于膜的近端區(qū)域，并被其上不同數(shù)量的結(jié)構(gòu)單元所掩蓋。

于沒有任何掩蔽的M0v細胞系，兩種分子在15小時和24小時的時間點顯示出幾乎不可區(qū)分的EC50和Emax，24小時的數(shù)據(jù)清楚地顯示出更高的最大殺傷率和顯著的左移EC50。對于M2v和M4v，在15小時的時間點，DbFc活性明顯低于基于IgG的分子。

然而，這兩種分子的劑量－效應(yīng)曲線在24小時時趨于一致，這個結(jié)果可能是由于T細胞活化的動力學(xué)差異導(dǎo)致，在足夠長的時間內(nèi)，EGF樣結(jié)構(gòu)域可能具有一定的結(jié)構(gòu)靈活性，允許暴露膜近端BCMA抗原。對于M7v細胞系，即使在24小時，DbFc的Emax也穩(wěn)定在約50％，低于基于IgG的分子，這表明在這種情況下，即使是柔韌性也不能克服空間位阻來補償DbFc橋接CD3和BCMA的低概率。

靶向不同表位的雙抗與體外活性的關(guān)系

為了深入了解表位位置如何影響雙抗的細胞殺傷活性，實驗人員在過度表達FLT3的EoL1急性髓系白血�。ˋML）細胞系上設(shè)計并研究了多種FLT3／ CD3雙特異性抗體分子。FLT3是一種受體酪氨酸激酶，其胞外結(jié)構(gòu)域由五個Ig樣結(jié)構(gòu)域組成。

結(jié)果顯示，與一系列表達BCMA的工程細胞系的研究結(jié)果一致，針對FLT3不同結(jié)構(gòu)域的雙特異性分子顯示出顯著不同的細胞毒性，其受到分子形式的強烈影響。靶向膜遠端結(jié)構(gòu)域D1和D3的DbFc介導(dǎo)了比其IgG對應(yīng)分子更有效的細胞毒性，可能是由于其使兩個細胞膜緊密結(jié)合的能力。

另一方面，針對膜近端結(jié)構(gòu)域D4和D5的IgG雙特異性分子誘導(dǎo)特異性靶細胞裂解，而對于DbFc形式的相同抗FLT3抗體，在高達10 nM的濃度下未觀察到顯著的細胞毒性。

小結(jié)

通過使用兩種形式（基于IgG和DbFc）的雙抗，對抗原表位位置和雙抗分子激活T細胞的體外效力之間的關(guān)系進行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗原表位位于膜遠端區(qū)域時，DbFc形式更有效，而基于IgG的雙特異性分子對于被其他結(jié)構(gòu)域掩蓋的膜近端表位更有效。

此外，在更具生物學(xué)相關(guān)性的背景下，針對FTL3抗原不同結(jié)構(gòu)域的雙特異性分子證實了這些發(fā)現(xiàn)。因此，在設(shè)計T細胞導(dǎo)向療法的雙抗分子時，除了考慮抗體的親和力，分子形式，抗原特性之外，還需要注意不同雙抗形式與抗原結(jié)合表位位置的關(guān)系。

參考文獻：

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