前言

基因治療是目前最火熱的治療領(lǐng)域之一,因?yàn)樗�針�?duì)的是疾病的潛在致病原因而不僅僅是癥狀。該療法可以誘導(dǎo)病變細(xì)胞中的基因表達(dá)或沉默,并已在臨床前試驗(yàn)中取得成功,但其臨床應(yīng)用依然受到基因載體免疫原性、致癌性、脫靶效應(yīng)和療效的限制。

基因治療成功的關(guān)鍵考慮因素是用于傳遞治療性核酸以表達(dá)或沉默基因的載體。重組病毒已被用作基因治療載體,在細(xì)胞攝取、基因整合和長期基因表達(dá)方面更為有效,尤其是在體內(nèi),但是它們具有免疫原性、潛在的致癌作用和繁瑣的制造過程。為了解決這些局限性,人們開發(fā)了能夠避免免疫反應(yīng)、具有廣泛的可調(diào)節(jié)性和質(zhì)量控制的非病毒載體,但它們的轉(zhuǎn)染效率低,并導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的被動(dòng)表達(dá)。

腺相關(guān)病毒(AAV)在基因治療方面的發(fā)展勢(shì)頭越來越大,越來越多的臨床試驗(yàn)將其用于各種治療。截至目前,FDA批準(zhǔn)的基于AAV的基因療法包括Sparktherapeutics的Luxturna和Avexis的藥物Zolgensma,分別用于治療遺傳性視網(wǎng)膜疾病和脊髓性肌萎縮癥。AAV因其較低的免疫原性和位點(diǎn)特異性整合能力被認(rèn)為具有更好的安全性。然而,抗AAV的中和抗體在大多數(shù)人群中普遍存在,這限制了AAV的系統(tǒng)應(yīng)用。人們目前的研究重點(diǎn)集中在工程化的AAV,通過對(duì)其衣殼進(jìn)行分子修飾、與小分子和聚合物偶聯(lián)和絡(luò)合以及包裝在各種人工和天然載體(包括囊泡、水凝膠和聚合物)中,用于提高安全性、療效和多模式治療。使用AAV載體進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的結(jié)果也強(qiáng)調(diào)了開發(fā)有效、安全和通用的載體在實(shí)現(xiàn)理想的基因治療方面的關(guān)鍵作用。

AAV的歷史與病毒學(xué)

AAV最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)60年代,被認(rèn)為是腺病毒培養(yǎng)的污染物。然而,隨著發(fā)現(xiàn)AAV只有在腺病毒存在下才能復(fù)制,以及后來的單純皰疹病毒1型(HSV-1)的存在,腺病毒和AAV之間的聯(lián)系很快建立起來。在確定AAV可以轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞后,研究人員開始生產(chǎn)重組AAV(rAAV)。含有腺病毒DNA的質(zhì)粒可以獨(dú)立于輔助病毒復(fù)制AAV。這一發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了該領(lǐng)域的發(fā)展,并真正開啟了AAV的基因治療領(lǐng)域。

AAV是一種小的、無包膜的細(xì)小病毒,在20-25nm的衣殼中基因組大小為?4．7kbp。基因組分為復(fù)制(REP)和衣殼蛋白質(zhì)(CAP)的兩個(gè)編碼區(qū),基因組兩端都有反向重復(fù)序列(ITR)。REP編碼與感染、整合和復(fù)制有關(guān)的四種蛋白質(zhì),Rep40、Rep52、Rep68和Rep78,而CAP編碼三種蛋白,VP1,VP2和VP3,它們分別以1:1:10的比例組成AAV的60-mer衣殼。VP3是最豐富的,構(gòu)成了外殼結(jié)構(gòu)的外部,而VP1和VP2構(gòu)成內(nèi)部。                          

AAV不能獨(dú)立復(fù)制,只有在輔助病毒(如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒)存在時(shí),才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染,否則只能建立溶源性潛伏感染。AAV將其基因組整合到19號(hào)染色體上的一個(gè)特定位置,即AAVS1,或在染色體外獨(dú)立復(fù)制。AAV是非致病性的,即使在其自然狀態(tài)下也不會(huì)引起任何疾病;此外,它沒有系統(tǒng)的固有性免疫反應(yīng)。總共發(fā)現(xiàn)了12種天然的AAV衣殼血清型,并命名為AAV1-AAV12,它們顯示出優(yōu)先與體內(nèi)特定組織結(jié)合的特性。

AAV不僅能感染活躍分裂的細(xì)胞,而且能感染靜止的細(xì)胞,這使得它對(duì)許多病毒和非病毒載體對(duì)基因傳遞不敏感的細(xì)胞群特別有價(jià)值,例如視網(wǎng)膜細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞。AAV感染靜止細(xì)胞的自然能力促進(jìn)了基因治療的許多顯著進(jìn)步,例如FDA批準(zhǔn)的治療Leber先天性黑朦的Luxturna(Spark Therapeutics)。

臨床上批準(zhǔn)的基于AAV的基因治療藥物

在過去的20年中,基于AAV載體的基于治療在臨床轉(zhuǎn)化中的相關(guān)性不斷提高,目前占全球基因治療臨床試驗(yàn)的8．1%。                      

第一個(gè)批準(zhǔn)在歐洲臨床使用的基于AAV的基因治療藥物是alipogene tiparvovec(AT),用于治療脂蛋白脂酶缺乏癥(LPLD),這是一種罕見的常染色體隱性疾病。該藥物于2012年獲得批準(zhǔn),商品名為Glybera。AT基因療法提供LPL基因的變體,LPLS447X,以糾正LPL患者LPL的功能。在III期臨床試驗(yàn)中,給藥AT后14周,低脂飲食后乳糜微粒的峰值水平降低了79%。

目前有17種美國FDA批準(zhǔn)的基因療法,包括AAV載體voretigene neparvovec rzyl(VN),由Spark Therapeutics于2017年開發(fā),商品名為Luxturna。VN包含一個(gè)包裹RPE6基因的AAV2,用于治療雙等位基因RPE65相關(guān)的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良癥,一種罕見的遺傳性疾病,導(dǎo)致視功能受損,隨年齡增長而下降,最終導(dǎo)致失明。在2012年進(jìn)行的III期臨床試驗(yàn)中(NCT00999609),Leber先天性黑朦2型患者接受視網(wǎng)膜下注射VN 1年后,65%的參與者獲得最大改善。在VN獲批之前,還沒有治療視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的藥物。

2019年獲得FDA批準(zhǔn)的第二種基于AAV的基因療法是Onasemogene abeparvovec xioi(OA),由AveXis開發(fā),商品名為Zolgensma。OA利用表達(dá)功能性SMN1轉(zhuǎn)基因的AAV9治療2歲以下兒童的I型脊髓性肌萎縮癥(SMA1)。SMA1的特點(diǎn)是腦干和脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能嚴(yán)重受損,并最終因呼吸衰竭死亡。它是導(dǎo)致嬰兒死亡的最常見單基因遺傳性疾病。在2017年一項(xiàng)名為STR1VE的三期臨床試驗(yàn)中(NCT03306277),接受治療后, 91%的患者在14個(gè)月時(shí)仍無需永久性呼吸支持,50%的患者在18個(gè)月時(shí)能夠獨(dú)立靜坐。下表列出了正在進(jìn)行和即將進(jìn)行的基于AAV的臨床試驗(yàn)。

應(yīng)用AAV的治療干預(yù)策略

最常見的AAV介導(dǎo)的治療干預(yù)是基因置換,其特點(diǎn)是引入基因的功能拷貝來治療單基因疾病。這種方法主要用于罕見和不可治療的疾病,是上述兩種FDA批準(zhǔn)的AAV基因治療的基礎(chǔ)。基因置換的另一個(gè)顯著例子是正在進(jìn)行的治療嚴(yán)重血友病A的臨床試驗(yàn),血友病A是凝血蛋白因子VIII缺乏癥。它是一種隱性的X連鎖疾病,在美國有三分之一的病例可由自發(fā)突變引起,在美國大約每5000個(gè)新生兒中就有1個(gè)發(fā)生這種疾病。在使用AAV治療血友病A的臨床試驗(yàn)的中,有三家預(yù)計(jì)將于2020年底或2021年初開始第三階段臨床試驗(yàn)(NCT04323098,NCT04370054,NCT03734588)。

基因添加是AAV基因治療最廣泛的應(yīng)用,因?yàn)樗�可以用來治療更常見的非單基因的�?fù)雜疾病,如慢性、自身免疫性或感染性疾病。AAV用于基因添加的例子包括正在進(jìn)行的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床試驗(yàn)。目前,Arthrogen正在進(jìn)行1期臨床試驗(yàn)(NCT02727764),AAV載體攜帶IFN-β的轉(zhuǎn)基因,一種在骨和軟骨保護(hù)中起作用的抗炎介質(zhì)。

與試圖克服功能缺失突變的基因置換不同,基因沉默,也稱為RNA干擾(RNAi),可以用來沉默有害的功能增益突變。在這種方法中,AAV轉(zhuǎn)基因?qū)�miRNA前體進(jìn)行編碼,該前體由靶細(xì)胞自身的RNAi機(jī)制處理,以產(chǎn)生miRNA,一種小的非編碼RNA鏈,能夠與mRNA內(nèi)的互補(bǔ)序列進(jìn)行堿基配對(duì)以抑制其表達(dá)。使用AAV進(jìn)行基因沉默的大多數(shù)努力仍在臨床前研究中,因?yàn)槌聊�有幾個(gè)特定的安全問題必須解決。一個(gè)主要問題是非靶點(diǎn)沉默的可能性。另一個(gè)問題是RNAi飽和的機(jī)制,在這種機(jī)制中,轉(zhuǎn)基因miRNA的表達(dá)可能壓倒并破壞內(nèi)源性miRNA的產(chǎn)生,從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性。目前,uniQure已經(jīng)開始使用AAV基因療法治療亨廷頓病的臨床試驗(yàn)(NCT049493)。

AAV應(yīng)用的挑戰(zhàn)

大多數(shù)成功的用于臨床前和臨床研究的AAV僅限于天然的衣殼血清型,但這些AAV血清型在臨床上的廣泛應(yīng)用存在明顯的局限性�？笰AV的中和抗體的存在仍然是全身輸送的一個(gè)重要障礙,這些中和抗體干擾AAV進(jìn)入靶細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和細(xì)胞核內(nèi)的解包裝,從而阻止了轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了更好地了解接觸AAV所產(chǎn)生的免疫反應(yīng),已經(jīng)進(jìn)行了一些研究,檢查了產(chǎn)生的IgG亞類,發(fā)現(xiàn)它們主要是IgG1。流行病學(xué)研究表明,在30-60%的人群中可發(fā)現(xiàn)血清陽性率不同的中和抗體。這些中和抗體中最流行的是針對(duì)AAV2的,其次是AAV1。

AAV介導(dǎo)的基因治療的另一個(gè)問題是基因組(4．7kbp)的大小限制,包括ITRs,給轉(zhuǎn)入的基因只留下一個(gè)?4．5kbp的大小空間,這將其靶向適應(yīng)癥縮小到只能是那些小片段轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

工程化AAV

AAV可以通過衣殼修飾、表面偶聯(lián)和封裝進(jìn)行設(shè)計(jì),以解決天然AAV的局限性。

AAV工程化的一個(gè)共同目標(biāo)是避免在全身給藥后血液循環(huán)中被中和抗體滅活。通過修飾中和抗體的衣殼結(jié)合位點(diǎn)來防止中和是一種很有前途的方法。然而,這些位點(diǎn)中的許多對(duì)AAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)是必不可少的,因此在不損害其功能的前提下對(duì)其進(jìn)行修飾具有挑戰(zhàn)性。此外,使用聚合物、脂類和水凝膠的表面栓系和包封都能夠保護(hù)AAV衣殼免受nAbs的侵襲,使其能夠逃避免疫系統(tǒng)的檢測(cè)和抗體反應(yīng)。

AAV工程的另一個(gè)好處是通過將組織特異性配體結(jié)合到衣殼、表面偶聯(lián)和包封材料來改進(jìn)靶向傳遞和活化。從封裝材料(如大孔徑的硅顆粒)中被動(dòng)釋放aav可以延長循環(huán)時(shí)間和延長輸送時(shí)間。對(duì)外界和內(nèi)部刺激(如光照、pH值變化或酶降解)有反應(yīng)的材料允許AAV在靶組織或細(xì)胞類型中釋放或激活,而磁性粒子結(jié)合的AAV則通過施加磁場定向到靶上。

工程化AAV也可以用來克服有限的基因組大小,并結(jié)合多種治療方式進(jìn)行多模式治療。疾病細(xì)胞中突變途徑中的多個(gè)基因可以通過傳遞兩個(gè)基因來重新編程,一個(gè)通過AAV,另一個(gè)通過表面偶聯(lián)或封裝的AAV載體中的第二個(gè)核酸;在組織工程支架中加入編碼AAV的生長因子可以通過基因激活和結(jié)構(gòu)支持促進(jìn)組織再生;聯(lián)合給藥和AAV同時(shí)干擾異�；顒�(dòng)和重編程病變細(xì)胞,從而產(chǎn)生協(xié)同治療效果。

展望

隨著全球市場上臨床認(rèn)可產(chǎn)品的出現(xiàn),以及越來越多正在進(jìn)行的成功臨床試驗(yàn),AAV正處于基因治療的前沿,但其較小的基因組和中和抗體限制了其在許多疾病中的應(yīng)用。工程化的AAV可以解決這些問題,同時(shí)提供了額外的好處,包括可控和刺激響應(yīng)釋放,擴(kuò)展的組織定向,以及多模式聯(lián)運(yùn)。多模式工程化AAV解決了AAV和單一模式基因治療的局限性,因?yàn)樗鼈儾粌H擴(kuò)展了治療潛力,而且可以協(xié)同作用于疾病本身的多個(gè)方面。目前正在探索的將第二種治療方式結(jié)合起來的工程化AAV是基因治療的一個(gè)尚未開發(fā)的領(lǐng)域,可以超越傳統(tǒng)的單一模式基因傳遞系統(tǒng)。雖然進(jìn)一步的技術(shù)進(jìn)步還需要推進(jìn)更多的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證,但多模式工程化AAV已經(jīng)在未來的基因治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

參考文獻(xiàn):

1．Synthetically Engineered Adeno-Associated Virus for Efficient,Safe, and Versatile Gene Therapy Applications． ACS Nano． 2020 Oct 19．

2． clinicaltrials．gov