前言

2021年5月28日,美國FDA宣布加速批準安進(Amgen)公司開發(fā)的Lumakras(sotorasib,AMG510)上市,用于治療腫瘤攜帶KRAS G12C突變的非小細胞肺癌(NSCLC)患者。這些患者至少接受過一種前期全身性治療。這是全球范圍內(nèi)首款靶向KRAS蛋白的抗腫瘤藥物。Lumakras是由安進公司開發(fā)的一款“first-in-class”的KRASG12C突變體抑制劑,Lumakras的獲批上市距離安進公司提交新藥上市申請(NDA),僅僅6個月。

AMG510結(jié)構(gòu)RAS基因被發(fā)現(xiàn)是腫瘤中最常見的突變基因之一,30%的腫瘤攜帶RAS變異,如果算上RAS調(diào)控因子和信號通路上下游的變異,幾乎覆蓋所有腫瘤,RAS變異每年造成一百萬以上的病人死亡,無愧是腫瘤基因之王。這也令人非常好奇,RAS到底具有什么神奇功能,令腫瘤細胞如此依賴?KRAS的發(fā)現(xiàn)史

RAS是第一個被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因(oncogene)。KRAS基因的全名叫Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog,翻成中文是“Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物”。KARS基因編碼的蛋白是一種小GTP酶(smallGTPase),它屬于RAS超蛋白家族。

19世紀末,巴斯德等巨匠的研究讓現(xiàn)代醫(yī)學在抗感染領域獲得巨大成功。1876年,一個俄羅斯人成功地將腫瘤組織從一只狗移植到另外一只狗。1908年,兩個丹麥科學家發(fā)現(xiàn)母雞白血病細胞中的提取物可以讓其它鳥類感染白血病。這些觀察和研究讓人們相信腫瘤也是病毒所致的傳染病。1910 年,洛克菲勒研究所的 PeytonRous 從一只來自紐約長島的母雞中發(fā)現(xiàn)了第一個腫瘤病毒 Roussarcomavirus(RSV,勞氏肉瘤病毒)。此后,一系列導致動物腫瘤的 RNA 和 DNA 病毒相繼被發(fā)現(xiàn)。致病機理也得到了合理地解釋:這些病毒(RNA病毒通過逆轉(zhuǎn)錄酶)可以將腫瘤基因整合到被感染的宿主細胞中,誘導惡變并維持腫瘤細胞的無限分裂。發(fā)現(xiàn)RSV的PeytonRous和發(fā)現(xiàn)RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的HowardTemin分別獲得1966年和1975年的諾貝爾生理醫(yī)學獎。至此,人們深信腫瘤是一種病毒導致的疾病。直到1974年,UCSF 的 J．MichaelBishop 和他的博士后 HaroldVarmus 通過 DNA 探針意外發(fā)現(xiàn)未被感染的正常細胞中也存在此前 RSV 病毒中發(fā)現(xiàn)的腫瘤基因 src。原來腫瘤基因早就存在于宿主的基因組當中,遠古時期,病毒從宿主細胞中獲得這些基因片段并加以改造,也就是說病毒所攜帶的腫瘤基因其實來自我們自身。這些發(fā)現(xiàn)打開了以基因變異為基礎的現(xiàn)代腫瘤生物學的大門。Bishop 和 Varmus 也因此在 1989 年獲得了該領域的第三個諾貝爾獎。Harvey 和 Kirsten 等人在 60 年代分別發(fā)現(xiàn)了類似于 RSV 的逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的老鼠腫瘤基因 HRAS 和 KRAS。1982 年,Weinberg 等實驗室在人類膀胱癌細胞T24/EJ中也發(fā)現(xiàn)了HRAS,使得RAS成為第一個被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤基因。KRAS基因及其相關(guān)通路

1． KRAS基因的分類

在人的基因組中,有 2 個 KRAS 基因。一個是 KRAS1,位于第6號染色體的短臂上;另一個是 KRAS2,位于第 12 號染色體的短臂上。其中,KRAS1 是“假基因”,不能被轉(zhuǎn)錄成 RNA,所以它是沒有功能的。而KRAS2才是“真基因”,能夠轉(zhuǎn)錄、并且翻譯成蛋白,具有生物學活性。通常公司和文獻報道中所研究的KRAS基因和蛋白,是指“KRAS2”基因及其蛋白產(chǎn)物。

KRAS基因?qū)儆赗AS基因家族。RAS基因家族當中,還有NRAS (neuroblastoma-RAS)和HRAS (Harvey-RAS)。

2． KRAS蛋白的結(jié)構(gòu)和位置

KRAS蛋白質(zhì)有188個氨基酸,它的分子量是21．6KD。擁有GTPase酶活性的鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白。

KRAS蛋白定位在細胞膜的內(nèi)側(cè),通過一個法呢�；�(Farnesyl)的修飾基團【1】,連到細胞膜上。法呢酰基,是通過翻譯后的蛋白修飾,在法呢酰基轉(zhuǎn)移酶【2】的作用下,加到KRAS蛋白上的【3】。

來源:Farnesyltransferaseinhibitorsinhematologicmalignancies:newhorizonsintherapy

3． KRAS相關(guān)通路

來源于網(wǎng)絡上游信號通路

正常細胞中,細胞膜上的EGFR、HER2、ErbB3和ErbB4等受體單體與細胞膜外配體結(jié)合形成二聚體,二聚體自身磷酸化,再磷酸化下游的信號蛋白。其中一條信號通路可激活Grb2-Shc,再激活SOS蛋白,進而可激活KRAS蛋白。

KRAS通路

在細胞內(nèi),KRAS蛋白在失活和激活狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變,當KRAS與鳥嘌呤核苷二磷酸(GDP)結(jié)合時,它處于失活狀態(tài),當它與鳥嘌呤核苷三磷酸(GTP)結(jié)合時,它處于激活狀態(tài),并且可以激活下游信號通路。

下游信號通路

大部分細胞中的KRAS處于失活狀態(tài),當它被激活后,可以激活多條下游信號通路,其中包括MAPK信號通路,PI3K信號通路,和Ral-GEFs信號通路。這些信號通路在促進細胞生存、增殖和細胞因子釋放方面具有重要作用。

4． KRAS活性的調(diào)節(jié)因子

KRAS在失活與激活狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換受到兩類因子的調(diào)節(jié)。

一類是鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF),這類蛋白催化KRAS與GTP的結(jié)合,從而促進KRAS的激活,其中包括SOS蛋白(屬GEFs/鳥苷釋放因子/鳥苷酸交換因子)。

另一類是GTP酶(GTPase)激活蛋白(GAPs),這類蛋白能夠促進與KRAS結(jié)合的GTP水解成為GDP終止活性狀態(tài),從而抑制KRAS的活性。

KRAS致癌基因的突變

由于 RAS 在許多重要細胞信號網(wǎng)絡的軸上處于中心位置,因此它們與許多癌癥標志有關(guān)。RAS是人類癌癥中最常出現(xiàn)突變的致癌基因,目前已經(jīng)在所有人類腫瘤的大約1/5中發(fā)現(xiàn)了突變引起的RAS蛋白激活。

在KRAS的基因突變中,97%是第12號或者第13號氨基酸殘基發(fā)生了突變。其中最主要的是G12D、G12V、G13D這三種突變。結(jié)構(gòu)學研究表明,這些基因突變大多干擾KRAS水解GTP的能力。

KRAS基因的三種主要突變

為什么說KRAS是“不可成藥“靶點?

既然KRAS如此重要,且KRAS基因上的致癌突變十分清楚,那么,為什么到現(xiàn)在為止,仍未上市一個直接針對KRAS基因的靶向藥物?原因在于KRAS蛋白是一種無特征、近乎球形的結(jié)構(gòu),無明顯結(jié)合位點,很難合成一種能靶向結(jié)合并抑制其活性的化合物。長期以來無法攻克,KRAS已成為腫瘤藥研發(fā)領域"不可成藥"靶標的代名詞。

困難點在于:

1) KRAS的作用泛圍很廣,KRAS的正�；钚砸彩窃S多正常細胞功能所需要的活性,如選取直接抑制KRAS的藥物,則該藥物毒性可能會很大,副作用也可能會很強。且KRAS與NRAS、HRAS有很高的同源性,能抑制KRAS活性的藥物,就很可能會抑制NRAS、HRAS的活性。那么,這個藥物的毒性就可能很大。

2) 目前已知的KRAS的活性功能域,主要是KRAS與GDP、或GTP結(jié)合的口袋狀的功能域。與蛋白激酶與ATP的親和力較弱不同, KRAS與GTP、或GDP的結(jié)合非常強,親合系數(shù)達到PicoMolar(皮摩爾濃度,10^-12)級。而正常細胞里面的GDP與GTP的濃度,達到了MicroMolar(微摩爾濃度,10^-6)級。所以,細胞內(nèi)正常的GDP與GTP的濃度,比與KRAS結(jié)合所需的濃度,高了10的6次方倍。而RAS缺乏足夠大的能夠結(jié)合小分子的口袋;故要做出一種小分子化合物,其與KRAS的結(jié)合能力,要能與GDP、或者GTP相匹敵,非常難。

3) 設計一種只針對性抑制突變KRAS蛋白的活性藥物,而盡量少影響正常KRAS蛋白的活性,需要此種化合物對突變的KRAS有很好的選擇性。這是藥物設計的又一個難題。

4) 然而,間接靶向KRAS的策略也是困難重重,包括阻斷KRAS細胞膜定位和靶向KRAS下游的信號分子,如RAF、MEK、ERK和PI3K等家族成員。具體而言,間接途徑的困難包括:(1)RAS是正常細胞生長和存活相關(guān)的必需途徑,靶向必需途徑首先面臨嚴重的毒副作用,導致療效指數(shù)非常狹窄甚至沒有;(2)補償逃逸機制,以及(3)由于嚴格調(diào)節(jié)導致的信號反饋和冗余。

靶向KRAS的藥物開發(fā)研究進展

近年來,針對KRAS突變體的共價抑制劑研究的突破讓通過異構(gòu)位點(allosteric)靶向KRAS突變體成為可能。在KRASG12C突變體中,與突變生成的胱氨酸共價結(jié)合的小分子更傾向與和GDP結(jié)合的KRAS蛋白相結(jié)合。而這一結(jié)合降低GTP與KRAS的親和力,同時阻礙GEF催化GTP替換GDP,將KRASG12C突變體鎖死在失活狀態(tài)。KRASG12C突變體上這一結(jié)合“口袋“的發(fā)現(xiàn)催生了多款靶向KRASG12C突變體的小分子共價抑制劑。以下是國內(nèi)外KRAS靶點藥物的在研企業(yè):

全球在研KRAS抑制劑(藥智網(wǎng)早前數(shù)據(jù),不完全統(tǒng)計)

中國在研KRAS抑制劑(藥智網(wǎng)早前數(shù)據(jù),不完全統(tǒng)計)