前言

近年來(lái)，利用藥物重新激活或增強(qiáng)免疫監(jiān)測(cè)的免疫治療成為一種新的、有希望的癌癥治療策略。2011年，CTLA－4的阻斷性抗體ipilimumab被批準(zhǔn)用于晚期黑色素瘤，開(kāi)創(chuàng)了免疫治療的新時(shí)代。一系列其他檢查點(diǎn)，如PD－1、PD－L1和LAG－3等的抗體也被廣泛開(kāi)發(fā)并批準(zhǔn)用于各種癌癥治療，這在一些臨床實(shí)踐中顯著提高了晚期癌癥患者的生存率。然而，以缺乏浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞或免疫細(xì)胞耗竭為特征的“冷”腫瘤微環(huán)境（TME）損害了免疫檢查點(diǎn)阻斷療法，因此需要開(kāi)發(fā)改進(jìn)的免疫治療策略。

追溯到現(xiàn)代免疫療法的起源，細(xì)菌早已被用作治療癌癥的藥物。William Coley在十九世紀(jì)將熱滅活鏈球菌和粘質(zhì)沙雷氏菌（稱(chēng)為Coley毒素）注射到惡性腫瘤組織中，觀察到了腫瘤的消退。因此，William Coley被譽(yù)為免疫治療之父。細(xì)菌免疫治療另一個(gè)成功的例子是卡介苗（BCG），它是一種減毒牛型結(jié)核分枝桿菌變異株，最初被設(shè)計(jì)為結(jié)核病疫苗，1990年被FDA批準(zhǔn)用于治療膀胱癌。

近年來(lái)，研究還證明了腫瘤內(nèi)細(xì)菌的存在和微生物群的免疫調(diào)節(jié)作用，表明腫瘤組織是細(xì)菌與腫瘤細(xì)胞和宿主相互作用的復(fù)合體。細(xì)菌幾乎涉及癌癥的所有生物學(xué)方面，如今，隨著對(duì)TME的深入了解以及微生物學(xué)、納米技術(shù)和重組DNA技術(shù)的快速發(fā)展，重新編程細(xì)菌的實(shí)現(xiàn)使細(xì)菌治療成為當(dāng)前癌癥研究和治療的新熱點(diǎn)。

細(xì)菌的天然優(yōu)勢(shì)

細(xì)菌具有腫瘤靶向性，其表面結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物也能激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，細(xì)菌在腫瘤免疫治療中具有作為治療劑或載體的固有優(yōu)勢(shì)。

細(xì)菌的腫瘤靶向性

腫瘤組織中的脈管系統(tǒng)通�；靵y且不規(guī)則，導(dǎo)致氧氣和營(yíng)養(yǎng)素的擴(kuò)散不足。因此，腫瘤中心區(qū)域通常呈現(xiàn)為缺氧環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，這一中心區(qū)域可以為一些專(zhuān)性兼性厭氧菌在系統(tǒng)給藥后定植和增殖提供場(chǎng)所。據(jù)報(bào)道，在靜脈注射鼠傷寒沙門(mén)菌3天后，小鼠腫瘤部位的細(xì)菌數(shù)與正常器官的比例超過(guò)10000：1。相反，僅依賴(lài)被動(dòng)分布和有限滲透性的傳統(tǒng)化療藥物，通過(guò)全身給藥，很難進(jìn)入這些血管稀疏的壞死區(qū)域，這通常導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。因此，細(xì)菌能夠在腫瘤核心定植，這是其他類(lèi)型藥物最難靶向的區(qū)域。

細(xì)菌的免疫激活特性

缺氧作為T(mén)ME的標(biāo)志，也會(huì)導(dǎo)致局部免疫細(xì)胞的功能抑制。隨著腫瘤的進(jìn)展，癌細(xì)胞不受控制的增殖剝奪了免疫細(xì)胞的氧氣和營(yíng)養(yǎng)。因此，免疫細(xì)胞往往會(huì)耗竭，通過(guò)分泌促癌細(xì)胞因子和趨化因子呈現(xiàn)抑制表型，并且無(wú)法對(duì)抗癌信號(hào)作出反應(yīng)。然而，細(xì)菌衍生分子如肽聚糖、脂多糖（LPS）和脂磷壁酸可以提供強(qiáng)大的免疫刺激信號(hào)。它們主要與固有免疫細(xì)胞，如樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和巨噬細(xì)胞表達(dá)的模式識(shí)別受體（PRR）結(jié)合，以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的遷移，刺激免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞。

例如，沙門(mén)氏菌LPS可以增加IL－1β的表達(dá)，并通過(guò)炎癥小體和Toll樣受體4（TLR4）介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。作為一些革蘭氏陰性細(xì)菌的結(jié)構(gòu)，鞭毛可以通過(guò)與樹(shù)突狀細(xì)胞上的Toll樣受體5（TLR5）結(jié)合，促進(jìn)各種促炎細(xì)胞因子、NO、H2O2和趨化因子的表達(dá)，增強(qiáng)CD8＋T細(xì)胞介導(dǎo)的殺瘤作用，并下調(diào)Treg細(xì)胞的抑制功能。

此外，細(xì)菌的某些成分可以介導(dǎo)免疫細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。例如，鞭毛蛋白可以介導(dǎo)促腫瘤巨噬細(xì)胞向抗腫瘤巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，將免疫抑制微環(huán)境轉(zhuǎn)化為免疫活性環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn)，李斯特菌可以感染MDSCs，降低血液中MDSCs的含量，并促進(jìn)剩余的MDSCs分泌IL－12，轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呋钚员硇汀Ｔ诶钏固鼐�治療的�?dòng)物模型中觀察到腫瘤生長(zhǎng)減少，這表明李斯特菌可以通過(guò)作用于MDSCs抑制腫瘤。

工程化細(xì)菌

細(xì)菌在腫瘤部位的趨化定植及其免疫原性使其成為免疫治療的理想候選者。據(jù)報(bào)道，在腫瘤組織內(nèi)檢測(cè)到幾種細(xì)菌，腫瘤內(nèi)輸送益生菌可促進(jìn)抗腫瘤免疫，為微生物在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著合成生物學(xué)、材料科學(xué)和基因編輯工具的發(fā)展，細(xì)菌工程已成為可能。通過(guò)不同的修飾和轉(zhuǎn)化方式，可以進(jìn)一步提高腫瘤的靶向性、治療效果和安全性。

工程化改善腫瘤傾向性

營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體的構(gòu)建是提高細(xì)菌靶向性的策略。根據(jù)正常組織和腫瘤部位所含營(yíng)養(yǎng)成分的差異，可以設(shè)計(jì)突變體，使其只能在腫瘤組織中定植和存活。其中，沙門(mén)氏菌A1和SF104是成功應(yīng)用的例子。沙門(mén)氏菌A1是一種亮氨酸和精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，而沙門(mén)氏菌SF104則表現(xiàn)出對(duì)芳香族氨基酸的需求，基因aroA發(fā)生突變，這兩種突變都會(huì)使細(xì)菌無(wú)法在正常組織中富集，但可以在腫瘤部位特異性聚集。

此外，合成工程化粘附素，專(zhuān)門(mén)用于結(jié)合特定的癌癥表達(dá)分子，如新抗原或癌細(xì)胞中豐富的其他分子，可以提高某些細(xì)菌對(duì)腫瘤的天然親和力。Bereta等人通過(guò)在鼠傷寒沙門(mén)菌VNP20009上表達(dá)癌胚抗原（CEA）的特異性單鏈抗體片段，觀察到腫瘤部位的細(xì)菌聚集增加。另一項(xiàng)研究中，通過(guò)將抗CD20抗體結(jié)合到沙門(mén)氏菌表面，增加了細(xì)菌對(duì)CD20＋淋巴瘤的侵襲性，同時(shí)減少了非特異性聚集。

工程化調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境

細(xì)菌的幾種基本成分能夠改變?nèi)梭w的免疫系統(tǒng)。然而，為了獲得更大的免疫調(diào)節(jié)效果，可以設(shè)計(jì)工程菌來(lái)裝載或表達(dá)外源性免疫治療藥物，以增強(qiáng)抗腫瘤療效。

鑒于細(xì)菌優(yōu)先定植于惡性區(qū)域并自然刺激固有免疫細(xì)胞，基于細(xì)菌的治療可以提供腫瘤組織中免疫激活的基線水平。細(xì)胞因子具有促進(jìn)免疫細(xì)胞活化和增殖的能力，通過(guò)工程菌傳遞細(xì)胞因子具有特異性高、副作用小的特點(diǎn)。一項(xiàng)研究通過(guò)使用減毒鼠傷寒沙門(mén)菌合成IL－18，通過(guò)增加腫瘤區(qū)域CD3＋／CD4＋T細(xì)胞和DX5＋NK細(xì)胞的浸潤(rùn)，IL－1β、TNF－α、IFN－γ、GM－CSF等細(xì)胞因子的表達(dá)增加，并觀察到抗腫瘤作用。

人乳頭瘤病毒16型癌蛋白E7（HPV－16 E7）在宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，是宿主細(xì)胞免疫所必需的。據(jù)報(bào)道，口服表達(dá)HPV－16 E7蛋白的乳酸乳桿菌可導(dǎo)致表達(dá)E7的腫瘤生長(zhǎng)顯著延遲，E7特異性CD4＋T輔助細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明這種基于細(xì)菌的疫苗對(duì)腫瘤細(xì)胞挑戰(zhàn)具有深遠(yuǎn)的保護(hù)作用。該口服疫苗還進(jìn)行了一期臨床試驗(yàn)，以驗(yàn)證其安全性和免疫原性。

工程化提高安全性

雖然細(xì)菌具有良好的抗腫瘤特性，但其潛在毒性是其應(yīng)用的主要障礙。另一方面，活菌制劑的安全性是其臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。為了充分利用細(xì)菌對(duì)抗癌癥，研究人員做出了巨大的努力來(lái)構(gòu)建大量的減毒工程菌，以提高其安全性能。

細(xì)菌表面分子是細(xì)菌的主要毒力，對(duì)這些表面抗原的修飾（如基因敲除）是規(guī)避活病原體毒性的主要途徑。例如，ppGpp（鳥(niǎo)苷5’－二磷酸－3’－二磷酸）是一種參與毒力基因表達(dá)的信號(hào)分子。通過(guò)敲除relA和spoT基因，ppGpp的合成被阻斷，導(dǎo)致其LD50比野生菌株增加105－106倍。由于能夠誘導(dǎo)促炎因子IL－1β、IL－18和TNF－α的分泌，ppGpp合成紊亂的細(xì)菌也表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。

工程菌在腫瘤聯(lián)合免疫治療中的研究現(xiàn)狀

研究表明，細(xì)菌可以作為免疫治療劑，增強(qiáng)抗腫瘤免疫。由于聯(lián)合治療是一種廣泛使用的提高總體療效的策略，細(xì)菌免疫療法也被作為化療、放療、光動(dòng)力療法和光熱療法聯(lián)合治療的一部分。

聯(lián)合化療

傳統(tǒng)的化療缺乏對(duì)惡性組織的特異性遞送，導(dǎo)致顯著的藥物全身暴露，這通常會(huì)產(chǎn)生劑量限制性毒性。利用工程菌作為藥物釋放系統(tǒng)進(jìn)行藥物控制釋放，以及利用其免疫原性進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，已成為研究的熱點(diǎn)。

Ektate等人將低溫敏感脂質(zhì)體附著在沙門(mén)氏菌膜上，在高強(qiáng)度聚焦超聲（HIFU）加熱的幫助下，介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)阿霉素的觸發(fā)釋放，從而在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中實(shí)現(xiàn)高效藥物遞送。此外，該菌株還使巨噬細(xì)胞極化為抗腫瘤M1表型，使Th1細(xì)胞群富含大量TNF－α，并降低IL－10的表達(dá)，從而在聯(lián)合化療－免疫治療方式中顯示出增強(qiáng)的治療效果。

除了利用活細(xì)菌，細(xì)菌外膜囊泡（OMV）是在生長(zhǎng)過(guò)程中由革蘭氏陰性細(xì)菌膜自然產(chǎn)生的，最近已成為多種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的免疫治療劑。Chen等人將載藥聚合物膠束封裝到細(xì)菌外膜囊泡中，細(xì)菌成分可以激活免疫反應(yīng)，而裝載藥物可以發(fā)揮化學(xué)治療和免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)清除癌細(xì)胞。

聯(lián)合放療

細(xì)菌輔助放射治療是一種新的腫瘤治療方法。在Jiang等人的一項(xiàng)研究中，研究了大腸桿菌與放射治療相結(jié)合的治療效果，表明在21 Gy的輻射和大腸桿菌產(chǎn)生細(xì)胞溶血素a的情況下，結(jié)腸腫瘤模型中的腫瘤顯著縮小。與單獨(dú)使用細(xì)菌治療相比，攜帶細(xì)胞溶血素a的細(xì)菌聯(lián)合放療可導(dǎo)致更多的腫瘤緩解。

此外，放射治療后，腫瘤釋放大量腫瘤抗原，這些抗原可被樹(shù)突狀細(xì)胞吸收和呈遞，導(dǎo)致特異性適應(yīng)性免疫反應(yīng)。然而，在免疫抑制性TME中，DC的數(shù)量通常較低，并且通常處于功能障礙狀態(tài)。Wang等人將涂有抗原吸附陽(yáng)離子聚合物納米粒的沙門(mén)氏菌注射到腫瘤組織中，這種納米�？梢圆东@放療后釋放的抗原，并將其運(yùn)出腫瘤核心，從而激活腫瘤邊緣組織中周?chē)�的DC。研究觀察到體外激活的DC大量增加，在多個(gè)腫瘤小鼠模型中存活時(shí)間延長(zhǎng)，顯示出增強(qiáng)的全身抗腫瘤作用。

聯(lián)合光動(dòng)力療法和光熱療法

由于標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤治療具有非特異性殺傷作用和復(fù)雜的手術(shù)操作，光動(dòng)力療法和光熱療法因其非侵襲性、高度特異性和良好的時(shí)空控制性而成為新的治療選擇。最近，許多研究試圖利用細(xì)菌作為載體來(lái)裝載PDT和PTT的治療劑，以利用細(xì)菌的腫瘤靶向性和免疫激活特性。

一項(xiàng)研究將光敏劑包覆的納米粒子整合到光合細(xì)菌聚球藻表面。在660nm激光照射下，光合細(xì)菌繼續(xù)產(chǎn)生氧氣，保證了活性氧的產(chǎn)生，增強(qiáng)了光動(dòng)力療法的效果。聚球菌作為免疫原性細(xì)菌，也通過(guò)上調(diào)MHC II類(lèi)分子和IL－12的表達(dá)來(lái)激活局部免疫。同時(shí)，這種治療方法通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面鈣網(wǎng)蛋白誘導(dǎo)免疫原性凋亡，并在三陰性乳腺癌模型中顯示出良好的治療效果。

小結(jié)

自第一次將卡介苗用作膀胱癌藥物的試驗(yàn)以來(lái)，人們一直在進(jìn)行不懈的實(shí)踐，以研究卡介苗在膀胱癌以外的癌癥治療中的作用。除卡介苗外，其他細(xì)菌制劑，如改良的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌株，也處于臨床前或臨床試驗(yàn)階段，以更好地驗(yàn)證其安全性和治療效果。

由于細(xì)菌是一種復(fù)雜而可行的治療藥物，在其增殖過(guò)程中一些不可控的突變可能會(huì)帶來(lái)潛在的毒性。它們固有的毒力也會(huì)導(dǎo)致免疫功能低下的癌癥患者發(fā)生復(fù)雜的感染。然而，合成生物學(xué)的快速發(fā)展使得通過(guò)基因編輯來(lái)獲得所需的細(xì)菌行為成為可能，依靠對(duì)工程菌靶向性的精確調(diào)控，可以實(shí)現(xiàn)藥物在腫瘤部位的特異性釋放，未來(lái)工程化細(xì)菌將成為腫瘤免疫治療的有力支持，使更多的癌癥患者獲益。

參考文獻(xiàn)：

1．Current Status and Future Directions of Bacteria－Based Immunotherapy． Front Immunol．2022； 13： 911783．

       原文標(biāo)題 : 腫瘤細(xì)菌免疫治療的研究現(xiàn)狀與未來(lái)方向