前言

在21世紀初，人類基因組計劃完成后，人們發(fā)現(xiàn)許多疾病是由基因突變導致功能蛋白表達不足引起的。然而，在藥物開發(fā)中，開發(fā)具有抑制或拮抗作用的藥物更容易。隨著大規(guī)模重組蛋白生產(chǎn)和純化技術(shù)的創(chuàng)新，蛋白質(zhì)替代療法，即重組蛋白在臨床上取得了成功，如治療糖尿病的胰島素。然而，這種方法主要適用于分泌的蛋白質(zhì)或酶，并且受到這些分子復雜的藥代動力學和成本相關(guān)問題的阻礙。此外，合成蛋白不太可能完全代表由選擇性剪接、翻譯后修飾和其他調(diào)節(jié)機制引起的蛋白質(zhì)內(nèi)源性功能的多樣性。

近年來，多種基于核酸的治療（NBT）方式已成為內(nèi)源性基因表達的有效和特異性激活劑。與基因治療補充基因表達的方法不同，RNA靶向療法通過選擇性調(diào)節(jié)內(nèi)源性RNA介導的細胞機制（如轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、mRNA穩(wěn)定性和亞細胞定位）增強蛋白質(zhì)生產(chǎn)的能力。

目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局已經(jīng)批準了幾種靶向剪接機制以調(diào)節(jié)突變外顯子的療法。這些方法可以特異性和可控地增加編碼和非編碼基因的表達，降低開發(fā)和制造成本，從而增加可治療疾病的范圍�；�于已證明的治療潛力和巨大的未滿足的醫(yī)療需求，NBT在未來將迎來更加快速的發(fā)展。

蛋白表達上調(diào)的生物學

治療性蛋白的上調(diào)可以通過調(diào)節(jié)細胞中蛋白質(zhì)生產(chǎn)的任何階段的生物過程來實現(xiàn)，包括轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯或翻譯后修飾。由于這些過程中的許多涉及DNA或mRNA，并由ncRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，因此它們特別容易受到NBT的調(diào)節(jié)。

轉(zhuǎn)錄激活是增加蛋白質(zhì)表達豐度研究最多的方法。遠端增強子元件通過染色體環(huán)與活性基因啟動子的物理相互作用募集轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)修飾物、中介復合體和RNA聚合酶II（Pol II），導致轉(zhuǎn)錄激活。啟動子區(qū)和增強子的雙向轉(zhuǎn)錄分別產(chǎn)生非編碼啟動子RNA（pRNA）和增強子RNA（eRNA）。從蛋白質(zhì)編碼基因座、反式作用的長非編碼RNA（lncRNA）、pRNA和eRNA的反義鏈轉(zhuǎn)錄的天然反義轉(zhuǎn)錄物（NAT）可以對靶基因進行表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

NAT的一個關(guān)鍵特征是，它們可以特異性地以順式或反式的方式調(diào)節(jié)其正義基因的轉(zhuǎn)錄、RNA加工和翻譯。此外，NAT還具有多種調(diào)節(jié)功能，包括吸附miRNA和與mRNA配對以提高其穩(wěn)定性。但它們中的大部分是通過協(xié)調(diào)抑制因子來抑制其靶基因的表達。因此，用反義寡核苷酸（ASOs）靶向NAT可以導致正義基因的去抑制和蛋白表達的增加。

此外，天然存在的修飾核苷酸，如N6-甲基腺苷、5-甲基胞嘧啶、N1甲基腺苷、假尿苷和2′-O-甲基化核糖，發(fā)生在mRNA和lncRNA的轉(zhuǎn)錄過程中。通過NBTs可以調(diào)節(jié)這些修飾從而影響轉(zhuǎn)錄和蛋白表達。翻譯效率還可能受到mRNA結(jié)構(gòu)特征的影響，使用NBTs阻斷或增強這些結(jié)構(gòu)的活性可能導致治療性蛋白表達上調(diào)。

臨床階段的NBT

在過去的5-7年里，NBT經(jīng)歷了爆炸性的增長，其中一些已經(jīng)獲得批準，而其他多種NBT正在進行臨床試驗中進行探索，下表顯示了已獲批的NBT。

調(diào)節(jié)拼接的NBT

突變引起的RNA剪接異常經(jīng)常導致非功能轉(zhuǎn)錄物被無義介導的降解（NMD）迅速破壞，導致受影響蛋白質(zhì)的短缺，這是許多疾病的基礎(chǔ)。此外，前mRNA的正常選擇性剪接可以包含所謂的“有毒外顯子”，導致轉(zhuǎn)錄物通過NMD快速降解，從而降低蛋白質(zhì)水平。ASOs與調(diào)節(jié)剪接事件的前mRNA上的特定序列結(jié)合，可以防止突變或天然非生產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生，并提高靶蛋白表達水平。

Vesleteplirsen（SRP-5051），是針對外顯子跳躍治療的下一個寡核苷酸新藥，其針對的是可以使用外顯子51跳躍治療的杜氏進行性肌營養(yǎng)不良（DMD）患者。在一項臨床試驗（NCT04004065）中，vesleteplirsen治療導致外顯子跳躍增加18倍，肌營養(yǎng)不良蛋白水平增加8倍。然而由于觀察到嚴重的低鎂血癥，該試驗暫時擱置，后來隨著對尿液生物標志物和鎂補充的擴大監(jiān)測而恢復。

WVE-N531，這是一種新型的全身給藥反義寡核苷酸療法，目前正在15名易發(fā)生外顯子53跳躍的DMD患者中進行臨床試驗（NCT04906460）。中期結(jié)果表明，該藥物的肌肉濃度很高，平均外顯子跳躍率為53%。藥代動力學數(shù)據(jù)顯示半衰期為25天，這可能支持每月給藥。WVE-N531的初步臨床結(jié)果表明，與亨廷頓舞蹈癥項目中的第一代DMD剪接轉(zhuǎn)換NBT和敲低NBT相比，其可能具有藥理學改善。

在用于治療其他疾病的剪接調(diào)節(jié)NBT中，sepofarsen（QR-110）在Leber先天性黑蒙的早期臨床試驗中顯示出陽性結(jié)果（NCT03913143）。Sepofarsen靶向CEP290內(nèi)含子26中的c.2991+1655A>G變體。STK-001是Stoke Therapeutics開發(fā)的用于Dravet綜合征的SCN1A靶向剪接切換的寡核苷酸，目前正處于I/IIa期臨床試驗（NCT04442295和NCT04740476）。

mRNA的遞送

與注射純化蛋白相比，將外源性mRNA引入病變細胞具有幾個優(yōu)勢，包括產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物的正確翻譯后修飾和亞細胞定位、較低的免疫原性、更簡單的制造過程和更低的成本。

治療性mRNA遞送技術(shù)的代表性臨床應用之一是由Translate Bio/Sanofi開發(fā)的用于囊性纖維化的CFTR mRNA療法MRT5005，該療法在II期臨床試驗（NCT03375047）中進行了測試。MRT5005由體外轉(zhuǎn)錄的、未修飾的CFTR mRNA組成，包裹在脂質(zhì)納米顆粒中，經(jīng)霧化以允許吸入輸送到肺部。MRT5005在囊性纖維化患者中的I/II期臨床試驗的中期結(jié)果顯示出良好的耐受性。肺功能結(jié)果參差不齊，部分患者的ppFEV1沒有明顯改善，而16毫克劑量組的3名患者從基線到第8天，平均最大增幅為15.7%。

由Moderna公司開發(fā)的mRNA-3927為丙酸血癥患者提供丙酰輔酶A羧化酶亞基α和β的雙重mRNAs。在進行的I/II期臨床試驗（NCT04159103）中，10名患者的耐受性良好，初步數(shù)據(jù)顯示，在疾病的自然過程中發(fā)生的臨床危機數(shù)量有所減少。

促進核糖體翻譯的小分子

NBT與RNA的相互作用是基于它們的序列互補性，而RNA靶向小分子（rSM）靶向RNA的3D結(jié)構(gòu)。使用rSMs調(diào)節(jié)RNA靶點的優(yōu)點包括口服可用性，以及在某些情況下的血腦屏障通透性。

RIBOTACs是一種類似于蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）進行蛋白酶體降解的小分子機制，其設(shè)計了與RNase募集部分相連的rSM，該募集部分可以靶向RNA進行降解，能夠上調(diào)疾病相關(guān)蛋白。有設(shè)計團隊通過在線計算平臺INFORNA鑒定了一種獲批的藥物，受體酪氨酸激酶抑制劑dovitinib是致癌前miR-21的選擇性結(jié)合物。通過將dovitinib改造為RIBOTAC，這種dovitinib-RIBOTACs能夠在小鼠模型中抑制乳腺癌癥細胞向肺部的轉(zhuǎn)移。

此外，DT-216是治療弗里德里希共濟失調(diào)的一種rSM，在I/II期臨床試驗中（NCT05285540和NCT05573698），DT-216顯示出良好的耐受性，單劑量給藥后，可使frataxin（FXN）mRNA在24小時內(nèi)增加1.2至2.6倍。

miRNA靶向NBT

近年來，miRNA已成為非常吸引力的治療靶點。合成寡核苷酸已被用于干擾該途徑，如miRNA模擬物（promirs）和miRNA阻斷劑（antagomirs）。根據(jù)miRNA的作用機制，這兩種干預類型都可能導致靶蛋白上調(diào)。

Remlarsen (MRG-201)是一種 miR-29的promirs，研究發(fā)現(xiàn)肺部疤痕組織的積累與miR-29的減少有關(guān)。因此，創(chuàng)造一種類似miR-29的分子的可能會逆轉(zhuǎn)這種疤痕。然而，由于高毒性，在人類的研究很快終止。隨后，miRagen/Viridian開發(fā)了新的、改進后的MRG-229分子，他們對該分子進行了化學改進，使其更加穩(wěn)定，并添加了一種肽，使其能夠更有針對性地傳遞。MRG-229在動物模型中耐受性良好，沒有產(chǎn)生任何不良反應。

miRNA阻斷劑的開發(fā)也已經(jīng)進行了很長時間，但該領(lǐng)域一直受到多次失敗的困擾。Regulus停止了RGLS4326的臨床試驗，RGLS4326抑制miR-17，用于治療常染色體顯性遺傳性多囊腎病。然后又開發(fā)了下一代候選分子RGLS8429取代，RGLS8429沒有觀察到RGLS4326的脫靶中樞神經(jīng)系統(tǒng)事件，目前，正在進行Ib期臨床試驗（NCT02855268）。

另外，在罕見腎臟疾病Alport綜合征（NCT05521191）的II期臨床試驗中，對一種抗miR-21的抗病毒藥物lademirsen進行了測試。盡管該藥物耐受性良好，但中期無效性分析結(jié)果導致研究終止。

NBT的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)

NBT的一些優(yōu)點使其非常適合于治療許多已知疾病導致的蛋白表達不足。NBT的特點是靶點特異性高，穩(wěn)定性好，半衰期大大延長（如數(shù)周或數(shù)月），不用頻繁給藥。已批準NBT的多項臨床試驗證明了其良好的耐受性。NBT的開發(fā)時間周期短、成本低，可以對快速發(fā)展的癌癥和罕見遺傳疾病進行個性化治療。

然而，與傳統(tǒng)的治療模式相比，NBT也都面臨著一些挑戰(zhàn)。目前NBT的一個常見缺點是它們無法穿過腸壁或血腦屏障。目前，這個問題可以通過靜脈、皮下、腦內(nèi)、側(cè)腦室或鞘內(nèi)給藥來解決。然而，這些方法是侵入性的，尤其是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遞送，有一定的可能造成不良影響。因此，需要進行更廣泛的研究，以開發(fā)化學修飾以及載體的給藥技術(shù)，從而減少侵入性遞送途徑。此外，與大多數(shù)小分子相比，NBT具有復雜且目前知之甚少的藥代動力學和藥效學。盡管存

在這些限制，但據(jù)報道，NBT開發(fā)的總體成功率與制藥行業(yè)的平均水平持平或高于平均水平。對2006年至2015年間進行的7455項藥物開發(fā)計劃的分析表明，進入臨床試驗的新分子實體藥物中只有約6%獲得批準。在這項分析中，新型生物制劑的成功率為11.5%。

小結(jié)

最近，NBT的進展為蛋白質(zhì)表達上調(diào)治療疾病開辟了巨大的新機會。新冠肺炎mRNA疫苗的成功將RNA靶向蛋白上調(diào)技術(shù)推到聚光燈下，并可能加速該領(lǐng)域的重大突破�；�因測序技術(shù)的改進，以及NBT在遺傳疾病中的可行性所激發(fā)的新希望，將導致遺傳研究的擴展。人類基因組學的重大進展使已知遺傳病因的疾病數(shù)量不斷增加。而這些都增加了NBT上調(diào)蛋白的適用性。

隨著對疾病基因組學和病理生理學理解的不斷發(fā)展，以及NBT技術(shù)、制造和監(jiān)管基礎(chǔ)設(shè)施的改進，NBT的臨床應用將不斷擴大，為更好地治療“罕見”疾病和個體化精準醫(yī)學開辟道路。

參考文獻：

1.Amplifyinggene expression with RNA-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov.2023May 30.

       原文標題 : RNA靶向基因激活療法