前言

TLRs是一種先天免疫受體，直接或間接負(fù)責(zé)檢測(cè)病原體相關(guān)分子模式（PAMP），并通過(guò)激活先天和適應(yīng)性免疫途徑對(duì)其作出反應(yīng)。天然存在和合成的TLR激動(dòng)劑可以利用這些內(nèi)源性免疫信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)和調(diào)節(jié)疫苗反應(yīng)，從而使其成為優(yōu)良的疫苗佐劑。每種TLR都有自己的特定組織定位和下游基因信號(hào)通路，TLR激動(dòng)劑可以與其他TLR或替代佐劑組合，以產(chǎn)生具有協(xié)同或調(diào)節(jié)作用的組合佐劑，這為研究人員提供了精確定制具有特定免疫效果的佐劑的機(jī)會(huì)。而決定何時(shí)用或不用TLR激動(dòng)劑作為疫苗佐劑，有許多重要的考量因素。

考量因素1：疾病機(jī)制和保護(hù)的相關(guān)性

選擇合適的TLR佐劑的第一步是了解疾病類型/作用模式和保護(hù)的相關(guān)性。例如，在傳染病（如冠狀病毒）的情況下，免疫反應(yīng)的水平和類型很重要，不正確的疫苗免疫反應(yīng)不僅不能保護(hù)個(gè)人免受疾病的侵害，而且可能導(dǎo)致疾病的進(jìn)展，這一過(guò)程被稱為疫苗增強(qiáng)疾病。

研究表明，當(dāng)針對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒（SARS-CoV）的重組刺突蛋白或滅活全病毒疫苗與Th2偏向性明礬佐劑搭配時(shí)，這與病毒攻擊后肺部嗜酸性粒細(xì)胞免疫病理學(xué)增加有關(guān)。而當(dāng)用Delta inulin (Advax™)加TLR9佐劑（CpG）配制疫苗抗原時(shí)，這種疾病增強(qiáng)效果得到了改善。此外，研究表明，促進(jìn)CTL活性的Th1型免疫是對(duì)抗腫瘤最有效的免疫反應(yīng)，而癌癥的疾病進(jìn)展與Th2免疫的偏斜有關(guān)。因此，針對(duì)TLR的佐劑，如TLR3、4、7、8或9，可誘導(dǎo)IRF7和IRF3激活，導(dǎo)致1型干擾素反應(yīng)，可能對(duì)癌癥疫苗制劑有利。在其他疾病中，如寄生蟲(chóng)，Th2偏向性免疫反應(yīng)更能減少疾病負(fù)擔(dān)，而Th1反應(yīng)可導(dǎo)致疾病增強(qiáng)。

免疫反應(yīng)的程度和持續(xù)時(shí)間也可能因疾病而異。例如，對(duì)于新冠肺炎，恢復(fù)期血清中和抗體滴度≥60被歸類為保護(hù)性，而對(duì)于日本人，腦炎病毒中和抗體滴度≥10被視為完全保護(hù)性。對(duì)于保護(hù)所需抗體水平較高的應(yīng)用，B細(xì)胞上的靶向TLR可能是提高抗體產(chǎn)生的有效策略。

考量因素2：給藥途徑

給藥途徑是一個(gè)重要的免疫參數(shù)，可以影響疫苗免疫反應(yīng)。除了傳統(tǒng)的疫苗給藥途徑，如皮內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi)，其他感興趣的給藥方式包括氣霧劑和鼻內(nèi)給藥，因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生粘膜免疫。粘膜免疫在預(yù)防腸道、呼吸系統(tǒng)和生殖道感染方面尤為重要。粘膜免疫可以產(chǎn)生分泌性IgA抗體和組織駐留的粘膜T細(xì)胞，為病原體入侵提供第一道防線。

TLRs在全身不同組織中差異表達(dá)，這可以影響誘導(dǎo)的免疫效果。如果組織部位的TLR豐度較低，可能導(dǎo)致次優(yōu)免疫反應(yīng)。研究證明，免疫途徑對(duì)基于TLR7和TLR8的利什曼原蟲(chóng)主要疫苗的療效有重大影響，保護(hù)性免疫僅在皮下接種后產(chǎn)生，而不是在肌肉內(nèi)接種。另一項(xiàng)研究表明，TLR4和TLR7/8佐劑疫苗根據(jù)給藥途徑在小型豬中產(chǎn)生不同的免疫結(jié)果。當(dāng)TLR4激動(dòng)劑（GLA-AF）和TLR7/8激動(dòng)劑（雷喹莫特，R848）皮內(nèi)聯(lián)合給藥時(shí)，GLA-AF增強(qiáng)了對(duì)R848佐劑的免疫反應(yīng)；但當(dāng)鼻內(nèi)聯(lián)合給藥時(shí)，GLA-AF消除了R848的佐劑活性。這些結(jié)果反映了不同組織區(qū)室之間固有感知群體和TLR表達(dá)模式的差異。

考量因素3：疫苗抗原特性

當(dāng)將佐劑與疫苗抗原結(jié)合時(shí)，重要的是要了解抗原是否具有免疫惰性，或者是否已經(jīng)含有固有的佐劑特性。例如，許多滅活的病毒抗原含有污染性DNA或RNA，其分別提供TLR9或TLR7的刺激，提供內(nèi)在的佐劑活性。在其他情況下，佐劑被有意嵌入疫苗抗原中，以增強(qiáng)免疫原性。胺修飾的R848通過(guò)巰基交聯(lián)劑結(jié)合到病毒A顆粒上，增強(qiáng)了TLR7/8佐劑活性的潛力，使抗流感IgG水平增加十倍。另一項(xiàng)研究中，研究人員制備了與Pam2Cys-SK4或Pam3Cys-SK4（TLR2激動(dòng)劑）融合的全長(zhǎng)ESAT6蛋白，產(chǎn)生協(xié)同作用發(fā)生顯著的局部CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。此外，四種高度保守的A組鏈球菌（GAS）抗原與成纖維細(xì)胞刺激性脂肽-1（TLR2激動(dòng)劑）偶聯(lián)時(shí)，可導(dǎo)致IgG抗體增加。

考量因素4：佐劑配方

佐劑的配方和呈現(xiàn)方式會(huì)對(duì)其整體安全性和功能產(chǎn)生重大影響。由TLR7激動(dòng)劑和結(jié)合SARS-CoV-2抗原的甘露糖組成的共聚物引發(fā)了強(qiáng)大的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，即使在老年小鼠中也是如此。 甘露糖成分通過(guò)其甘露糖結(jié)合受體促進(jìn)APC對(duì)抗原和TLR7激動(dòng)劑的內(nèi)吞作用。該策略允許有效遞送至感興趣的靶向免疫細(xì)胞，因此僅需要較低劑量的抗原和佐劑。此外，在病毒樣顆粒上高密度展示TLR5激動(dòng)劑增強(qiáng)了佐劑的免疫原性和安全性，同時(shí)降低了系統(tǒng)性IL-6釋放引起的毒性。而TLR7/8激動(dòng)劑在超支化聚合物中的高密度呈遞降低了脫靶毒性和快速全身清除，同時(shí)增強(qiáng)了體液反應(yīng)。

除了影響歸巢到特定組織區(qū)外，疫苗抗原/佐劑復(fù)合物的局部持續(xù)時(shí)間可能在形成細(xì)胞和體液免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，TLR7在明礬上的吸附產(chǎn)生了儲(chǔ)庫(kù)效應(yīng)，允許TLR激動(dòng)劑的緩慢控制釋放。最近，有研究配制了聚合物納米顆粒水凝膠，使TLR7/8配體和血凝素蛋白能夠緩慢釋放，這導(dǎo)致小鼠對(duì)單次注射的抗體滴度增加。

另一種制劑策略是將TLR佐劑直接偶聯(lián)到抗原上，這促進(jìn)了佐劑和抗原對(duì)相同APC的刺激。然而，研究結(jié)果喜憂參半。有研究設(shè)計(jì)了電荷修飾的肽TLR7/8偶聯(lián)物，其自組裝成納米顆粒，從而增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的免疫原性和腫瘤清除率。然而，在其他研究中，TLR5配體與抗原的共表達(dá)導(dǎo)致免疫原性降低。而在體外將TLR2配體與乙肝病毒核心蛋白的合成長(zhǎng)肽偶聯(lián)物導(dǎo)致單核細(xì)胞衍生和原代DC亞群的交叉呈遞效率較低。

近年來(lái)的新疫苗技術(shù)包括基于mRNA、DNA和病毒載體的疫苗。其中一些新疫苗具有固有的佐劑特性。TriMix是一種基于mRNA的佐劑，由編碼共刺激分子CD70、CD40L和TLR4激活分子的mRNA分子組成。在癌癥疫苗研究中，TriMix佐劑已被證明可增加DC成熟和CTL反應(yīng)。新冠肺炎腺病毒載體疫苗也已被證明具有自佐劑特性，并激活TLR9，導(dǎo)致I型IFN分泌。

考量因素5：不同年齡組TLR佐劑作用的變異性

TLR的表達(dá)依賴于年齡和組織。在新生兒中，TLR被證明是下調(diào)的，而在老年人群中，TLRs變得失調(diào)。TLR2/6激動(dòng)劑酵母多糖和TLR2激動(dòng)劑β-葡聚糖在臍血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞因子反應(yīng)。有研究探索了許多含有Poly I:C、MPLA或R848的TLR激動(dòng)劑組合，以評(píng)估它們是否能誘導(dǎo)強(qiáng)大的Th1免疫反應(yīng)。出乎意料的是，添加TLR9激動(dòng)劑CpG寡核苷酸顯著降低了臍血IFN-γ水平，添加TLR2激動(dòng)劑誘導(dǎo)了高IL-13，這是一種Th2極化細(xì)胞因子。這些研究的局限性在于，它們是在人類臍帶血上進(jìn)行的離體研究，在新生兒動(dòng)物模型和嬰兒中進(jìn)行免疫研究仍然很重要。與年輕患者相比，TLRs的表達(dá)和活性在老年患者中失調(diào)�？朔�老年人免疫衰老的最有效策略可能是同時(shí)觸發(fā)多個(gè)TLR。

參考文獻(xiàn)：

1.Toll-like receptor (TLR) agonists as a driving forcebehind next-generation vaccine adjuvants and cancer therapeutics. Curr OpinChem Biol.2022 Oct;70:102172

       原文標(biāo)題 : 基于TLR激動(dòng)劑佐劑的設(shè)計(jì)