應用科學是基礎(chǔ)科學通向

產(chǎn)業(yè)實踐的必經(jīng)之路

合成生物學采用工程科學研究理念，對生物體進行有目標地設(shè)計、改造乃至重新合成，創(chuàng)建賦予非自然功能的“人造生命”�；�因測序、編輯及合成技術(shù)、計算生物學、人工智能等一系列底層賦能技術(shù)的突破加速合成生物學發(fā)展，從此開創(chuàng)了以構(gòu)建分子機器 (體外催化) 和細胞工廠 (體內(nèi)催化) 為代表的合成生物制造的新興生物工程領(lǐng)域，拉開了合成生物學在各個領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化應用的序幕。

從終產(chǎn)物合成位置的角度來看，生物合成路徑分為胞內(nèi)生產(chǎn)和胞外生產(chǎn)。胞內(nèi)生產(chǎn)即搭建細胞工廠，通過對底盤細胞的改造、胞內(nèi)酶和代謝通路的改造和調(diào)控等，使微生物直接代謝終產(chǎn)物。細胞工廠目前廣泛應用于大宗化學品和天然產(chǎn)物的生產(chǎn)。胞外（體外）生產(chǎn)關(guān)鍵點在于無細胞酶促體系的構(gòu)建，對催化酶進行理性/半理性設(shè)計實現(xiàn)進化，在體外構(gòu)建酶級聯(lián)反應以簡化工藝流程，某些流程還可結(jié)合化學合成提高收率。雖然細胞工廠利用整合的概念一勞永逸地將代謝物轉(zhuǎn)化所涉及到的所有酶一并構(gòu)建在細胞內(nèi)，但是體外酶催化具有獨特優(yōu)勢。合理應用底層賦能技術(shù)搭建應用平臺，同時從產(chǎn)業(yè)化與商業(yè)化視角出發(fā)正確選擇終產(chǎn)物的生產(chǎn)方式，對于合成生物企業(yè)來說至關(guān)重要。

因此，一個合格的合成生物平臺企業(yè)要想從基礎(chǔ)科學向產(chǎn)業(yè)實踐轉(zhuǎn)化，細胞工廠構(gòu)建、酶的定向進化和篩選、無細胞酶促合成體系和與化學合成的結(jié)合是必修課。

胞外生產(chǎn)

催化酶的改造和篩選

酶具有在催化反應時不會改變自身的結(jié)構(gòu)或被消耗、可重復使用、反應條件簡單易控、高效催化等特點，因此成為了合成生物學研究當中的關(guān)鍵元件，通過對于不同酶元件的組裝，研究人員在許多目標分子反應路線的設(shè)計上取得了突破。

物種在自然界中進化伴隨著酶的進化，而酶的定向進化是一個建立在分子基礎(chǔ)上的人為過程，它將天然進化過程轉(zhuǎn)移到實驗室并進行加速。酶的定向進化的實質(zhì)是一個迭代過程，包括確定起始酶（定向進化起點)、基因多樣化、酶蛋白質(zhì)表達和功能篩選、再多樣化、再篩選等，直到在酶活性、結(jié)合親和力或特異性方面達到令人滿意的性能水平，即達到定向進化終點。盡管定向進化功能強大，其高成本、高耗時以及對部分反應缺乏起始模板等問題的存在，限制了其在工業(yè)應用上的廣泛推廣，因此理性設(shè)計和半理性設(shè)計等設(shè)計策略應運而生，用以優(yōu)化酶的性能，或是改變酶的反應底物、反應路線等。

由半理性設(shè)計邁向理性設(shè)計

催化酶的改造研究已有超40年的歷史：1978年Hall首先開始了實驗室酶的定向進化以探索新功能酶；2001年David 開始蛋白的從頭設(shè)計建模；2010年Anderson 通過電腦對酶進行重新設(shè)計來解決細菌耐藥性問題；2018年Arnold 因?qū)γ付ㄏ蜻M化的杰出貢獻獲得諾貝爾化學獎。整體看來，酶的改造歷史由原先的人工選擇定向進化，逐步進入半理性設(shè)計與理性設(shè)計階段。

與人工選擇的酶定向進化不同，酶的半理性設(shè)計策略，具體是基于分子層面上對酶的氨基酸序列精準引入突變，使酶活性位點及附近或酶表面發(fā)生的突變有助于優(yōu)化催化活性，從而產(chǎn)生更有效的酶庫。這是一種基于酶氨基酸序列-酶空間結(jié)構(gòu)-酶功能三者之間關(guān)系的理解結(jié)合隨機引入突變的方法。具體步驟在編輯酶的部分片段基因中引入突變，形成酶的基因突變庫 ；利用蛋白質(zhì)表達載體對酶進行表達，形成酶蛋白質(zhì)突變庫；對酶的功能進行選擇或者篩選；判斷本輪進化是否達到目的以及決定是否進行新一輪定向進化。酶半理性設(shè)計對自動化、高通量設(shè)備要求極高，要求高通量挑蛋白、挑菌落、精準滴液及培養(yǎng)自動化，均需要軟硬件的配合。

酶的半理性設(shè)計策略在工業(yè)應用廣泛，在Merck與Codexis開發(fā)的Islatravir酶合成工藝中充分體現(xiàn)了這種酶半理性設(shè)計應用的普適性。該設(shè)計包含以下幾個基本步驟：1) 通過酶資源庫信息分析比對、篩選具有該活性的酶；2) 利用酶與底物結(jié)合信息創(chuàng)建小的突變體庫進行篩選；3) 對整個基因進行隨機突變篩選(可循環(huán)多輪)。

當前，以定點突變?yōu)槠瘘c的半理性設(shè)計目前已發(fā)展成為兩個分支：一是根據(jù)蛋白質(zhì)一維的氨基酸序列，進行隨機突變、定向篩選，獲得性能提高的突變體。二是根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和催化機制，以理性的方式選取擬改造活性位點并構(gòu)建突變體來提高酶的性能。而隨著計算和人工智能技術(shù)的發(fā)展，理性設(shè)計正使半理性設(shè)計的兩個分支正在呈現(xiàn)合二為一的趨勢，開發(fā)從DNA序列到蛋白質(zhì)功能的新酶設(shè)計策略和人工智能新算法，在先進算法指導下進行計算機虛擬篩選及從頭設(shè)計，顯著提高了蛋白質(zhì)改造的效率。

與半理性設(shè)計不同的是，酶的理性設(shè)計需要知道詳細的結(jié)構(gòu)和基因信息，直接定點設(shè)計所需要的催化劑。由于結(jié)合了計算化學、計算生物學、有機化學、酶學、結(jié)構(gòu)生物學、蛋白質(zhì)理性設(shè)計、定向進化等多領(lǐng)域的專業(yè)知識，理性設(shè)計降低了傳統(tǒng)誘變與人工篩選所帶來的工作量，一定程度地擺脫了高成本、長周期消耗，同時借助高通量篩選，精準實現(xiàn)了催化酶的定向改造。

當前國內(nèi)部分企業(yè)已具有催化酶的理性設(shè)計能力，例如，合成生物學領(lǐng)跑企業(yè)瑞德林正在建立全國第一個二肽酶庫，覆蓋22種氨基酸的400余種組合，可快速完成新酶挖掘、功能改造、表達系統(tǒng)建立及催化工藝優(yōu)化，以應用到生物合成中改變原有功效護膚、營養(yǎng)健康等原料化學合成的方式，推動降本增效，改變原料格局。

我國研究團隊也在催化酶的挖掘取得巨大進步，涌現(xiàn)出了一批出色的研究團隊。來自華南師范大學的黃華研究員長期專注于微生物酶資源的鑒定與改造，實現(xiàn)微生物代謝、微生物發(fā)酵以及微生物酶工業(yè)催化的理論與應用研究�，F(xiàn)承擔國家自然科學基金“酶組學”面上項目“酶組學法揭示糖酸在人體微生物中的轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡”。

黃華 研究員

華南師范大學

無細胞酶促合成體系的構(gòu)建

酶催化聚焦于酶的設(shè)計與改造，以體外無細胞形式執(zhí)行生物合成，是合成生物學在體外反應的一種表現(xiàn)形式。

相較于胞內(nèi)合成，生物體外催化能通過對多個酶在實際生產(chǎn)條件下的性能進行工程化改造，多個酶同時參與級聯(lián)反應來簡化工藝流程，減少中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物的產(chǎn)生，避免了副產(chǎn)物對細胞的毒害，提高收率與純度，同時節(jié)省了生產(chǎn)成本，尤其在合成一些結(jié)構(gòu)簡單且常用化合物時體外酶促體系優(yōu)勢更為明顯。

相較于復雜化學路線，體外酶級聯(lián)反應也往往頗具競爭力。傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中使用的化學合成存在操作過程繁瑣、設(shè)備要求較高、工業(yè)排放量污染環(huán)境、產(chǎn)品純度低、副產(chǎn)物較多等痛點。相比之下，酶催化技術(shù)的優(yōu)勢更加明顯，不僅避免了使用有毒催化劑，還能最大限度降低能耗，不需要投入過大的成本，在降低溶劑使用量的基礎(chǔ)上，保證最終產(chǎn)品純度更高。

對于復雜結(jié)構(gòu)的人工合成藥物，最早的原研路線通常為多步化學法，近年來，出于綠色環(huán)保、節(jié)約能源的角度，如何將原有的化學法轉(zhuǎn)化為體外酶催化級聯(lián)法也已成為一大新興研究領(lǐng)域。在Merck與Codexis利用9種酶成功構(gòu)建了HIV治療藥物Islatravir的體外多步酶法催化級聯(lián)體系，該路線總收率達到51%，所需步驟遠少于之前報道的化學路線（12-18步）。酶法不但無需化學反應中常用的保護基團，同時還能提供對立體選擇性的精確控制，這可能是該酶級聯(lián)反應能夠縮短步驟并提高產(chǎn)率的主要原因。

無細胞酶促合成體系的構(gòu)建核心在于酶催化級聯(lián)反應體系的構(gòu)建，有多種類型，目前最通用的分為以下四類：a)線性級聯(lián)反應; b)正交級聯(lián)反應; c)平行級聯(lián)反應; d)循環(huán)級聯(lián)反應。經(jīng)典的例子是重要手性藥物中間體——手性胺，采用的是線性級聯(lián)反應，同樣能夠完成輔酶（如NADH）的循環(huán)。實際的級聯(lián)反應中，通常不會只應用一種反應類型，而是多類結(jié)合應用，氧化還原酶、轉(zhuǎn)氨酶等則是其中最常應用的酶類。

國內(nèi)有許多關(guān)于酶促合成并成功推向產(chǎn)業(yè)化的案例。來自華東理工大學的鄭高偉教授團隊緊密圍繞“藥物手性砌塊的高效酶促合成”開展應用基礎(chǔ)研究，重點解決酶應用中天然酶與非天然底物不適配及酶與工業(yè)應用環(huán)境不兼容關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。團隊通過3年時間開發(fā)了一條（R）-硫辛酸不對稱合成的綠色酶催化技術(shù)，使得產(chǎn)品合成步驟縮短一半，產(chǎn)品收率提高一倍以上，生產(chǎn)成本降低27%，三廢排放減少45%。

體外酶促合成體系雖然發(fā)展勢頭迅猛，但仍然存在一些挑戰(zhàn)：一是輔酶循環(huán)的問題，體外循環(huán)需要用到ATP、NADPH等價格昂貴的輔酶，除了成本問題外，在構(gòu)建循環(huán)體系時需同時考慮輔酶循環(huán)體系。二是酶的穩(wěn)定性問題，部分酶在體外的穩(wěn)定性較差，大規(guī)模穩(wěn)定生產(chǎn)存在困難。三是多酶協(xié)作的問題，體外多酶的協(xié)作往往不如在體內(nèi)有序高效。四是酶的重復利用問題，當大規(guī)模反應后，酶用量將成為不可忽視的成本。五是處理分離的問題，有些反應中，產(chǎn)物與酶一樣，高度溶解于水相，不易用結(jié)晶、鹽析等便捷的方法與酶有效分離，將面臨后續(xù)分離的巨大成本問題。

化學-酶法的應用

化學合成長期以來一直用于制備復雜化合物，尤其是那些難以從天然來源獲得的化合物，可以通過新反應、新試劑、新路線，合成毫克級至噸級的產(chǎn)品，現(xiàn)有的實驗設(shè)備、工業(yè)設(shè)備、產(chǎn)業(yè)鏈十分成熟、完善。盡管化學合成存在污染等問題，至今仍是不可替代的生產(chǎn)方式。

生物合成的出現(xiàn)解決了合成化學發(fā)展以來面臨的幾個問題：1）能源問題：化學合成原料來源屬于非再生資源，如石油等；2）工藝問題：反應步驟多，反應條件嚴苛，提取困難等；3）環(huán)境污染問題：合成化學有機溶劑大量使用引起環(huán)境污染，1948年獲得諾貝爾醫(yī)學獎獲得者Paul Hermann Müller是DDT分子的發(fā)現(xiàn)者和推廣者，而后DDT分子被證實引起了嚴重環(huán)境污染。

生物合成的應用也不是一蹴而就，存在其應用劣勢，現(xiàn)階段還無法完全替代合成化學。其中，生物合成相較于合成化學最主要的劣勢是生物系統(tǒng)本身的可控性及天然酶對非天然產(chǎn)品的適用性較差，其次生物催化工藝的開發(fā)往往周期漫長，投入巨大，嚴重限制了合成生物技術(shù)的推廣。

因此，未來的生產(chǎn)方式應是酶催化和生物發(fā)酵融合于化學合成方法中，化學合成和生物合成兩大生產(chǎn)方式不存在零和博弈，而是共生成長。目前已有大量通過化學-酶法制備醫(yī)藥中間體、天然產(chǎn)物的案例。

一碳化合物可被微生物利用并轉(zhuǎn)化為多種平臺化合物，生物制造路線雖有助于甲烷氣體減排，可拓寬生物制造原料來源。但亟需突破一碳化合物生物利用效率低、轉(zhuǎn)化途徑匱乏等難題，通過使用化學-酶法，建立高效的化學和生物級聯(lián)催化路線可克服這些問題，實現(xiàn)一碳氣體的高效耦合和集成利用。

化學-酶法開發(fā)領(lǐng)域也涌現(xiàn)出了一批優(yōu)秀的研究團隊。中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員袁波，師從英國曼徹斯特大學Nicholas. J. Turner教授，長期專注于生物催化、酶工程、酶固定化以及功能性分子合成的研究。具體研究方向包括：生物催化的手性氧化還原反應，利用半乳糖氧化酶等酶催化的手性拆分、去消旋化反應進行復雜分子的合成；軸手性化合物的生物催化轉(zhuǎn)化反應，利用酶催化或級聯(lián)反應進行軸手性化合物的合成;納米雜合酶固定化體系創(chuàng)制與應用，利用新型功能性納米材料進行雜合體系創(chuàng)制與反應擴大化及其應用研究。

袁波 研究員

中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所

化學-酶法實現(xiàn)了化學合成與生物合成有機結(jié)合，使用化學-酶法合成天然產(chǎn)物具有高化學選擇性、高立體選擇性、高產(chǎn)率、低毒性等優(yōu)勢，在合成路徑短的工藝中具有一定的優(yōu)勢，因此將化學-酶法引入合成工業(yè)具有廣闊前景。

胞內(nèi)生產(chǎn)——細胞工廠

胞內(nèi)生產(chǎn)即搭建細胞工廠，通過對底盤細胞的改造、胞內(nèi)酶和代謝通路的改造和調(diào)控等，使微生物直接代謝終產(chǎn)物。微生物細胞工廠（microbial cell factories, MCFs）已被廣泛用于生產(chǎn)豐富多樣的化學品、食品、藥品和能源，是生物合成的核心環(huán)節(jié)。與體外酶催化生產(chǎn)方式不同的是，細胞工廠的最佳應用場景是大宗品/超大宗品和天然產(chǎn)物的生產(chǎn)上。

細胞工廠的構(gòu)建

（1）底盤細胞構(gòu)建關(guān)鍵環(huán)節(jié)

細胞工廠的構(gòu)造是胞內(nèi)生產(chǎn)的關(guān)鍵點，圍繞底盤細胞的選擇與改造、基因合成、基因組編輯、合成途徑設(shè)計等技術(shù)路線開展。其中，主要的底盤細胞包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、谷氨酸棒桿菌、釀酒酵母、絲狀真菌以及非模式細菌、非傳統(tǒng)酵母等，構(gòu)建細胞工廠需在底盤細胞的基礎(chǔ)上應用調(diào)控、進化、高通量篩選等。

在細胞工廠的構(gòu)建中，涉及到的關(guān)鍵底層技術(shù)包括1）基因組編輯技術(shù)、2）多基因同時調(diào)控技術(shù)、3）基因動態(tài)調(diào)控技術(shù)、4）高通量篩選技術(shù)、5）代謝調(diào)控機制。

（2）天然產(chǎn)物的生物合成

目前市場上超過40%的小分子藥物來源于天然產(chǎn)物及其類似物，雖然天然產(chǎn)物在人類已知化合物庫中的占比較小，發(fā)展成為藥物的比例卻很高，尤其是在抗感染和抗腫瘤藥物方面達到了50％，挖掘自然界中天然產(chǎn)物的價值，并以人工高效的方式制備天然產(chǎn)物，是學界和產(chǎn)業(yè)關(guān)注的兩大研究熱點。20世紀以來，有機化學家們通過有機反應實現(xiàn)天然產(chǎn)物在實驗室內(nèi)的全合成，但化學合成法的局限性在于難以適配于結(jié)構(gòu)高度復雜的分子，部分反應化學試劑昂貴且反應條件極其苛刻，整體合成效率較低。因此，通過構(gòu)建微生物細胞工廠生物合成天然產(chǎn)物的路線，成為業(yè)界關(guān)注點。

利用生物發(fā)酵法合成天然產(chǎn)物及其中間體在工業(yè)生產(chǎn)中已有許多案例，包括萜類化合物、生物堿等。重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸，該工藝替代復雜化學工藝與提取法，成為了當前莽草酸生產(chǎn)的首選路線；青蒿素是我國發(fā)現(xiàn)的第一個被國際公認的抗瘧首選天然藥物，其結(jié)構(gòu)為含過氧橋基團結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，目前通過細胞工廠方法生產(chǎn)青蒿素已初步達到工業(yè)化生產(chǎn)水平；通過將設(shè)計改造的紫杉二烯合成酶導入大腸桿菌中，通過對模塊進行調(diào)控獲得生產(chǎn)紫杉醇前體化合物，產(chǎn)量比舊路線提高了1萬倍以上。國內(nèi)清華大學李春教授長期從事代謝工程與合成生物學、生物催化與酶工程的研究，聚焦甘草萜烯類和黃酮類天然產(chǎn)物的酶轉(zhuǎn)化與微生物合成，工業(yè)菌種智能抗逆分子設(shè)計與工程應用。已完成植物油脂酶法脫膠、甘草次酸的生物制造、多重耐熱酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等技術(shù)的中試試驗，研制的植物解鹽促生菌劑實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化應用。

李春 教授

清華大學化學工程系

目前，利用合成生物學手段實現(xiàn)實際社會生產(chǎn)中的天然產(chǎn)物合成仍然存在著諸多挑戰(zhàn)。例如原核表達系統(tǒng)、細胞內(nèi)無高級細胞器、缺乏轉(zhuǎn)錄后修飾，而酵母作為真核表達系統(tǒng)必須人為地將內(nèi)含子從蛋白質(zhì)編碼序列中刪除。越來越多的生物技術(shù)，如構(gòu)建基因庫、蛋白質(zhì)工程、高通量篩選以及 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)等的發(fā)明與應用可解決上述難題。這些不斷完善的新生物合成工具正隨著具有重要藥用價值的生物次生代謝物的生產(chǎn)成本與資源協(xié)調(diào)等相關(guān)問題的解決，逐步創(chuàng)造著更加可觀的未來。

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       原文標題 : 應用科學，讓合成生物學從基礎(chǔ)科學向產(chǎn)業(yè)實踐轉(zhuǎn)化