文章背景簡介

細胞呼吸、感染過程及化學(xué)、物理因子均可產(chǎn)生活性氧（ROS）。ROS會誘導(dǎo)DNA的堿基氧化及單鏈斷裂（SSBs），這種DNA損傷可被堿基切除／單鏈斷裂方式修復(fù)（BER／SSBR）。假如不修復(fù)，ROS誘導(dǎo)的損傷就會阻礙DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，從而產(chǎn)生突變，進而驅(qū)動腫瘤發(fā)生。BER和SSBR均通過DNA聚合酶修復(fù)形成長片段或短片段，在DNA連接酶III或DNA連接酶Ⅰ的作用下進行連接。

在活細胞中，ROS誘導(dǎo)的DNA損傷可在時間和空間范圍內(nèi)進行修復(fù)，而染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對于DNA修復(fù)過程是至關(guān)重要的。利用含有旋轉(zhuǎn)定位尿嘧啶的重組核小體進行的體外研究表明在染色質(zhì)損傷的情況下，BER酶的催化活性會受到抑制，ATP酶染色質(zhì)重構(gòu)因子SWI／SNF對8－oxoG BER的去除作用非常弱，說明染色質(zhì)重構(gòu)會促進BER。

2013年，匹茲堡大學(xué)的Li Lan等人在《Nucleic Acids Research》（IF＝11．561，生物1區(qū)）發(fā)表了題為“Novel method for site－specific induction of oxidative DNA damage reveals differences in recruitment of repair proteins to heterochromatin and euchromatin”的文章。本文使用特異性的熒光蛋白KillerRed （KR），在活細胞的特定基因位置產(chǎn)生ROS誘導(dǎo)的氧化損傷。利用這種基于活化KR生成ROS的潛在機制，研究開發(fā)了一個可視化實驗系統(tǒng)，通過將tetR－KR或TA－KR定位表達在人類細胞中特定的常染色質(zhì)或異染色質(zhì)位點上，從而可以實時觀察BER酶在特定位點的募集情況。

所用到的主要方法

1、熒光原位雜交；

2、染色質(zhì)免疫共沉淀；

3、乙炔基尿苷滲入檢測RNA合成；

4、流式細胞術(shù)；

5、KR 激活；

6、細胞存活（MTT和菌落形成測定）

文章主要內(nèi)容摘要

活性氧（ROS）誘導(dǎo)的DNA損傷可以通過堿基切除修復(fù)途徑進行修復(fù)。但染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對損傷位點BER蛋白的募集影響尚不清楚。為了解決這個問題，本研究開發(fā)了一種新方法，將光刺激產(chǎn)生ROS的誘導(dǎo)因子KillerRed （KR）與tet－阻遏因子（tetR－KR）或轉(zhuǎn)錄激活因子（TA－KR）融合，特異性地產(chǎn)生ROS，誘導(dǎo)DNA損傷。在U2OS細胞中，TetR－KR或TA－KR分別與90kb的TRE結(jié)合，整合在特定的基因組位點，誘導(dǎo)異染色質(zhì)或常染色質(zhì)中ROS的損傷。研究發(fā)現(xiàn)在異染色質(zhì)和常染色質(zhì)中，DNA糖苷酶可有效地募集到DNA損傷位點，PARP1則更有效募集到濃縮染色質(zhì)中，相反，F(xiàn)EN1募集到活性染色質(zhì)的DNA損傷位點，并且以PCNA－和轉(zhuǎn)錄激活依賴的方式高度富集。這些結(jié)果表明，氧化性DNA損傷在異染色質(zhì)或常染色質(zhì)中的修復(fù)方式是不同的。