從臨床的腫瘤診療從放、化療時代過渡到靶向、免疫治療時代開始,按照生物標記物劃分腫瘤類型,逐漸成為一種與傳統(tǒng)的按原發(fā)器官分類并行的腫瘤區(qū)分方式。在越來越多的腫瘤新藥適應癥里,已經不會簡單羅列*期*癌,而是出現了如EGFR基因突變的III期肺癌、HER2基因突變的III期乳腺癌等字樣。

2017年,FDA批準帕博利珠單抗用于治療 dMMR/MSI-H 型不可切除或轉移性經治的實體瘤患者。這是全球首個直接根據生物標記物劃定適應癥的泛癌種腫瘤藥物,讓微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)這一熱門的腫瘤免疫標記物得到了監(jiān)管層的官方認證。

微衛(wèi)星,即人類基因組中的短串聯(lián)重復序列(STR),包括單核苷酸的重復、雙核苷酸的重復,甚至更多核苷酸的重復。微衛(wèi)星遍布人類基因組中,目前知道的微衛(wèi)星已經達到1900萬個左右。

基因組中的微衛(wèi)星示意圖

1997年,美國國家腫瘤研究所(NCI)首次對MSI進行了定義。與正常組織相比,腫瘤組織中由微衛(wèi)星重復單元的插入或缺失所導致的微衛(wèi)星長度的改變,稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定,是腫瘤中常見的第5種突變類型,MSI-H腫瘤即指具有微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定表型的腫瘤。

據統(tǒng)計,2015年,中國有約450萬癌癥新發(fā)病例。對于被檢測為MSI-H的患者,其適用的腫瘤治療方案往往與沒有發(fā)生這類突變的患者不同,因此,國內越來越多的基因檢測公司開始為腫瘤患者提供MSI檢測服務,但一直沒有監(jiān)管批準的MSI檢測產品上市。

這種狀況持續(xù)到2021年。1月下旬,國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準了桐樹基因申請的“微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)檢測試劑盒(多重熒光PCR-毛細管電泳法)”,該試劑盒是國內首個獲得NMPA批準的微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測試劑盒,在臨床上為醫(yī)生制定個體化診療方案提供參考依據。成立4年,桐樹基因擒獲MSI檢測首證,背后是一條怎樣的注冊報批之路?首證落地,MSI檢測和腫瘤精準醫(yī)療將發(fā)生如何變革?近日,動脈網對桐樹基因創(chuàng)始人嚴令華進行了專訪,嘗試解答這些問題。

MSI-H人群疾病負荷大,臨床病理特征獨特

我們談及腫瘤基因突變,通常是指點突變、插入/缺失、融合和擴增。這類基因突變往往造成某一兩個基因功能異常,從而引發(fā)其所在的通路信號傳遞異常,惡性腫瘤就在這個過程中發(fā)生、發(fā)展。MSI-H腫瘤也有相似的產生邏輯,但更為復雜。

處于編碼區(qū)的MSI導致移碼突變,會觸發(fā)相關基因功能失活,由于微衛(wèi)星數量龐大且遍布整個基因組,因此位于多個基因上的微衛(wèi)星不穩(wěn)定將會導致與腫瘤相關的多個信號通路中的多個基因功能異常,進而導致MSI-H腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

MSI-H 的表型最早是在遺傳性結直腸癌中被發(fā)現,但后來的研究發(fā)現,MSI-H 腫瘤發(fā)生于多個部位中,最常見的發(fā)生部位為結直腸、子宮內膜和胃,同時也發(fā)生于其他部位。

各個癌種的MSI-H患者比例

如果根據各個癌種MSI-H的發(fā)生率估算,每年新發(fā)MSI-H腫瘤患者達到30多萬,這個數字與每年新發(fā)乳腺癌病例數相當,遠高于前列腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等其他高發(fā)腫瘤。與此同時,不同MSI-H腫瘤患者在臨床病理、分子病理方面往往具有相似的特征。

MSI-H腫瘤與其他癌種年新發(fā)病理數比較 數據來源:JCO Precis Oncol

例如,有研究表明,MSI多發(fā)生在II期結直腸癌、近端結腸,并且MSI-H型腫瘤具有分化較差、伴有粘液成分、淋巴管血管、T細胞浸潤等臨床病理上的特征。同時,MSI-H腫瘤是具有分子共性的,研究表明,MSI的現象多見于KRAS野生型、BRAF突變型、PIK3CA突變型,TMB-H的患者中,且特定的通路MMR、WNT、PI3K和NOTCH的基因突變在MSI-H腫瘤中存在富集現象,這與腫瘤起源的部位是無關的。也就是說,MSI-H腫瘤是一類獨特的腫瘤,擁有一套獨有的分子發(fā)生機制,并具備特殊的臨床/分子病理特征。

由此可見,以MSI作為區(qū)分腫瘤類型的生物標志物,一方面能夠找出數量龐大的同類型患者,這些患者具有差異化的腫瘤治療需求;另一方面,帶有MSI-H生物標志物特征的腫瘤患者,通常具有相似臨床病理、分子病理特征,可以幫助臨床醫(yī)生制定、優(yōu)化針對MSI-H型腫瘤患者的完整治療方案。這也是MSI檢測的臨床價值日益受到重視的底層邏輯。

MSI檢測的4大臨床價值

MSI檢測最早被用在林奇綜合征的篩查中。林奇綜合征曾被稱作遺傳性非息肉病性結直腸癌((Hereditary non-polyposis colorectal cancer,HNPCC),是遺傳性腫瘤中發(fā)生率最高的一類。MSI 檢測可以作為林奇綜合征的初篩手段,對于確定為MSI-H 的患者,則采用林奇綜合征致病基因MMR的胚系突變檢測,來明確診斷。

此外,MSI檢測在臨床上被廣泛應用在結直腸癌、胃癌等腫瘤的預后判斷和輔助化療療效預測中,篩選出需要在手術后接受進一步化療的患者。

近年來,MSI檢測最熱門的一項應用,便是腫瘤免疫治療的響應預測。

丁香園在《微衛(wèi)星不穩(wěn)定百科全書》中介紹,微衛(wèi)星不穩(wěn)定會產生大量的移碼突變(Frameshift mutation),導致閱讀框變化,造成下游的一系列密碼子改變,產生完全不同的肽鏈,也被稱為“移碼肽”(Frameshift peptides,FSP)。這些移碼肽作為新抗原,具有高度的免疫原性,引起腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)的免疫應答,由此可見,這也是 MSI-H 腫瘤對免疫治療敏感的原因之一。其次,MSI-H腫瘤通常伴有高腫瘤突變負荷(Tumor Mutation Burden,TMB),而高TMB也是免疫治療敏感的標志之一。

2015年的一項臨床研究首次證明,MSI-H 型的結直腸癌患者能夠從帕博利珠單抗的治療中獲益。后續(xù)的多項臨床研究更是將能夠響應免疫治療的MSI-H患者拓展到超過10種腫瘤。換言之,MSI檢測被證明是一種泛癌種的腫瘤免疫響應預測手段。

到2020年,最新公布的KEYNOTE-177 研究結果顯示,相較于化療,帕博利珠單抗作為 MSI-H轉移性結直腸癌的一線治療方案具有臨床意義和統(tǒng)計學意義。這一研究結果,進一步擴大MSI檢測在腫瘤免疫響應預測中的應用范圍。在美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)的結直腸癌診療指南中,已經把MSI檢測作為選擇一線治療方案的必要程序,并在超過10種腫瘤中,推薦采用MSI檢測進行免疫響應預測。

主要癌種的MSI臨床應用場景數據

嚴令華指出,理論上,所有確診的結直腸癌患者、確診的胃癌患者、確診的子宮內膜癌患者、確診的小腸腺癌患者、需進行林奇綜合征篩查的腫瘤患者、尋求免疫治療的所有實體瘤患者,都有必要做MSI檢測。其中,早期患者主要采用MSI檢測進行預后判斷、林奇綜合征篩查和輔助化療,晚期患者則主要用MSI檢測來做免疫響應預測�！�

前期,由于沒有注冊的產品上市,MSI檢測主要通過LDT(臨床實驗室自建項目)的方式來完成,全國每年只能做到10萬例左右。嚴令華告訴動脈網,“這對于30萬MSI-H患者的覆蓋十分有限,我們預計臨床MSI檢測的需求每年有150萬例。”

合理的MSI檢測,微衛(wèi)星位點檢測Panel的選擇是關鍵

在 MSI 診斷中,檢測位點(Panel)的設置,往往決定了檢測結果的假陽性率或者假陰性率。國際上權威的MSI檢測Panel有兩個,一個是NCI Panel,由 2 個單核苷酸位點(BAT-25 和 BAT-26)和 3 個雙核苷酸位點(D2S123、D5S346 和 D17S250)組成,也就是著名的2B3D Panel。另一個是Pentaplex Panel,包括5 個單核苷酸微衛(wèi)星位點,BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-22和NR-24。

桐樹基因從2016年末開始聯(lián)合國內頭部的腫瘤學科專家,開展MSI相關的臨床研究,已經積累下超過2萬例MSI檢測患者數據,發(fā)表近30篇學術論文。在嚴令華看來,這些研究成果最核心的意義在于,驗證了2B3D Panel在中國人群MSI檢測中的有效性,為更多MSI檢測產品設計提供循證依據。

“盡管2B3D是許多國際指南認定的權威Panel,但支撐這些共識的都是基于歐美人群的研究數據,中國人群的遺傳性特征是不一樣的。”嚴令華指出,“桐樹基因用了3項臨床研究來回答中國人群應該采用哪種MSI檢測Panel的問題�！�3項臨床研究分別是,NCI Panel與Promega Panel的頭對頭比較分析;NCI Panel、Promega Panel與24個位點Panel的對比研究;MSI檢測與顯微切割對比的腫瘤異質性研究。

臨床研究表明,中國人群的NCI Panel敏感性相比Promega Panel高18%,24位點Panel的敏感性最低。也就是說,MSI檢測的位點選擇并不是越多越好,而是要選擇經過驗證的位點,從而提升檢出率。桐樹基因的第三項臨床研究表明,MSI檢測幾乎不受腫瘤異質性影響,驗證了MSI檢測可以提供更高質量的臨床證據。

對于桐樹基因MSI檢測的Panel設定,嚴令華的把關或許有點嚴苛。經過大規(guī)模的臨床檢驗后,嚴令華才最終敲定開發(fā)基于2B3D NCI Panel的MSI檢測試劑,在這期間,桐樹基因沒有向患者開放商業(yè)化的MSI檢測服務,堅持臨床研究的客觀性�！癙anel選擇是MSI檢測開發(fā)的關鍵,這個環(huán)節(jié)出現問題,就很難保證產品品質�！眹懒钊A強調。

目前,《中國臨床腫瘤學會(CSCO)結直腸癌診療指南 2020 版》、《結直腸癌分子標志物專家共識》(2018 版)、《遺傳性結直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識》(2018 版)及《ESMO 共識:腫瘤免疫治療中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測建議及其與 PD-1/PD-L1 表達和腫瘤突變負荷的關系》(2019 版)等多個國內外指南和共識,都推薦用2B3D NCI Panel進行MSI檢測。

據了解,桐樹基因抽調了科研、醫(yī)學、產品等部門的近20人團隊,專門從事MSI檢測臨床研究。除了前述3項關鍵的Panel研究外,桐樹基因還開展了覆蓋約3000名MSI-H患者的腫瘤發(fā)生率研究,探索結直腸癌、胃癌、子宮內膜癌、肝癌、腦膠質瘤等癌種患者的MSI-H比率。MSI-H患者的腫瘤發(fā)生率研究是一個冷門領域,但卻為指導臨床腫瘤精準醫(yī)療提供了重要的參考。此外,桐樹基因布局了MSI-H患者的PD-1用藥前瞻性臨床研究。從已經入組的患者治療情況看,MSI檢測與PD-1療效具有明確的相關性。

用“120分”的產品去申報注冊

嚴令華坦言,從成立桐樹基因之初,他想做的就是合規(guī)的檢測產品。在嚴令華看來,IVD企業(yè)應該定位于為醫(yī)生提供好用的檢測工具,只有服務好了醫(yī)生,才能最終造福患者。MSI檢測是其中一個方向。

桐樹基因開發(fā)MSI檢測產品的初心,與嚴令華父親的患癌經歷不無關系。10多年前,嚴令華的父親被診斷出患有晚期胃癌。在手術后的6段輔助化療剛剛進行到第2段時,父親不良反應非常嚴重。嚴令華敏銳地意識到,父親可能是MSI-H患者,接受輔助化療的效果可能并不好。后來的檢測驗證了嚴令華的猜測,父親于是停止了輔助化療,現在的健康狀況依然很好�！爱敃r,我確信,MSI檢測是真的是廣大胃腸腫瘤患者所需要的,”嚴令華說,“我們的目標是讓每位需要做MSI檢測的患者接受合格的MSI檢測�！�

所以在選定2B3D NCI Panel、啟動相關驗證之后,桐樹基因也第一時間與監(jiān)管層、臨床專家溝通,要證明在大規(guī)模的臨床應用中,試劑盒的準確率可以達到99%,甚至100%。“嚴令華表示,”這就意味著,從研發(fā)階段開始,就要做出100分,乃至120分的產品,否則到注冊檢驗階段注定會失敗�！�

桐樹基因提交的注冊申報材料中包含1000余例患者臨床試驗數據,但是早期的引物選擇、方法學驗證則實施了上萬例的MSI檢測。根據監(jiān)管層的要求,桐樹基因采用多種對照方法對MSI檢測試劑盒進行了驗證,包括一代測序、IHC(免疫組化)、NGS(二代測序)。

在臨床實踐中,除了PCR+毛細管電泳的金標準方法可以評估MSI狀態(tài),IHC也常用于MMR蛋白的檢測,間接反映MSI的狀態(tài)。

MSI 狀態(tài)由 MMR 蛋白功能異常導致,IHC法的原理通過對 MMR 系統(tǒng)中 4 個主要的蛋白(MLH1、MSH2、MSH6 及 PMS2)表達的檢測來反映 MSI 的狀態(tài)。IHC 方法成本低、耗時少,在國內醫(yī)療機構病理科的普及性較高。有研究顯示,IHC 和PCR+毛細管電泳法的一致性可以達到 85% 以上。

不過,IHC 判讀識別對病理醫(yī)師要求很高,檢測結果容易受判讀人員的主觀因素影響,產生假陰性和假陽性。此外,IHC 檢測的一抗選擇對陽性和陰性的判斷至關重要,操作流程難以標準化和規(guī)范化,從而無法保證 IHC 結果的可重復性,影響檢測結果。因此,嚴令華認為,將PCR+毛細管電泳法與IHC法相結合,是現有條件下更可靠的MSI檢測方式。

不同技術路徑的MSI檢測對比

近年來,隨著分子生物學發(fā)展和NGS測序成本的降低,全外顯子組測序和多基因靶向區(qū)域測序逐漸也應用于 MSI 的檢測中。NGS 通量大,靈敏度高,采用NGS Panel一次性可以檢測上千個 MSI 位點、MMR 基因狀態(tài)及其他分子標志物。但在嚴令華看來,由于 NGS 數據分析更為復雜,需要明確統(tǒng)一的算法及評判標準對 MSI 進行評估,而這種檢測方式進入臨床應用,則需要更多中國人群的數據積累和驗證。

MSI產品初步定型后,桐樹基因的臨床試驗設計歷時近半年。這期間,他們反復與行業(yè)內的專家溝通,用前期積累的研究數據一家一家敲定參與注冊臨床試驗的醫(yī)療機構。

嚴令華告訴動脈網,他十分感謝桐樹基因MSI產品注冊申報的這段經歷,也從中學到了很多,“這個過程體現了所有人都本著為患者負責的態(tài)度,我們就應該這樣去做�！�

從10萬例到150萬例

接受動脈網專訪的時候,距離NMPA正式批準桐樹基因的MSI檢測產品上市已經過去了一周,嚴令華仍難掩激動�！斑@個產品獲批,必然會深刻改變MSI檢測市場,但是我認為更重要的是,MSI-H患者距離更精準的臨床治療方案又進了一步。”嚴令華說到,“首先是穩(wěn)定性,把MSI檢測放到醫(yī)院內來做,肯定是更可靠的。其次是時效性,以往MSI檢測把樣本外送,集中檢測后傳回結果,中間需要4～5天,而院內的MSI檢測最快當天就能出結果�！�

試劑盒上市后,MSI檢測也將在臨床場景中發(fā)揮更大的價值。以腫瘤免疫響應預測為例,按照國家衛(wèi)健委要求,應選擇取得相關資質的檢測試劑來指導抗腫瘤藥物的使用。選擇免疫治療的腫瘤患者往往病情危重,藥物價格也較高,采用合規(guī)的MSI檢測,對醫(yī)生和患者都形成保護。

目前,桐樹基因已經整合了20人的商務團隊,在未來2～3年中,將MSI檢測試劑送到全國的醫(yī)療機構中。據嚴令華預測,國內能夠提供MSI檢測的醫(yī)療機構至少有200家,如果按照每家醫(yī)療機構每年完成1000～1500例MSI檢測計算,MSI檢測試劑將成為腫瘤精準醫(yī)療領域年需求量最大的檢測單品。

從目前臨床醫(yī)生溝通的結果看,MSI檢測臨床需求非常強烈,只是遲遲沒有合規(guī)產品上市,很多醫(yī)院很難選擇。產品注冊證落地后,桐樹基因已經陸續(xù)接到了許多醫(yī)療機構的采購意向�！八�以產品注冊證落地,會為MSI檢測樣本量從10萬例提高到150萬例輸出強勁動力。”嚴令華推測,首證發(fā)出后,或有更多的MSI檢測試劑,將充分滿足臨床對MSI檢測的需求。

對于桐樹基因而言,獲得MSI檢測產品注冊證,是精準醫(yī)療創(chuàng)新和探索的一個重要節(jié)點,但遠不是終點。嚴令華表示,接下來,在大力推動MSI檢測試劑快速覆蓋臨床需求的同時,桐樹基因會在腫瘤精準醫(yī)療的另外兩個方向持續(xù)發(fā)力,爭取未來實現ctDNA和大Panel腫瘤NGS檢測的關鍵突破。

寫作參考:

丁香園:《微衛(wèi)星不穩(wěn)定百科全書》

腫瘤時間:微衛(wèi)星不穩(wěn)定-不能忽視的腫瘤指標

春雨醫(yī)生:結直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)檢測及其臨床意義

作者:王世薇