前言

肝細(xì)胞癌是全球第六大最常見的惡性腫瘤，在2020年導(dǎo)致數(shù)十萬人死亡，然而，目前晚期肝細(xì)胞癌患者的治療選擇仍然有限。腫瘤免疫治療近年來發(fā)展迅速，尤其是在免疫檢查點抑制劑（ICI）領(lǐng)域，這些藥物旨在激活和增強抗腫瘤免疫，為晚期癌癥患者的治療提供了新的前景，包括肝癌。

目前，atezolizumab（抗PD－L1阻斷劑）聯(lián)合bevacizumab（VEGF抗體）在肝癌患者展示出令人鼓舞的臨床結(jié)果。盡管如此，目前只有一小部分肝癌患者受益于ICI治療，免疫相關(guān)不良事件（IRAE）的發(fā)生率也是一個重要問題，這突出表明需要更好地了解ICI與腫瘤的相互作用，以及識別免疫治療反應(yīng)的預(yù)測性生物標(biāo)記物。

PD－L1

PD－L1在腫瘤細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞表面廣泛表達(dá)。據(jù)報道，PD－L1在HCC中的表達(dá)普遍較低（約占腫瘤細(xì)胞的10％），并且與復(fù)發(fā)和更短的OS相關(guān)。

已經(jīng)發(fā)表了一些臨床試驗結(jié)果，其中PD－L1被評估為ICI反應(yīng)的預(yù)測性生物標(biāo)志物。在CheckMate 459 III期臨床試驗中，盡管nivolumab并未引起OS的顯著改善，但PD－L1陽性腫瘤患者對nivolumab的反應(yīng)優(yōu)于索拉非尼。然而，PD－L1的預(yù)測價值尚不清楚，在CheckMate 040和NCT02658019試驗中，無論PD－L1表達(dá)水平如何，所有患者的應(yīng)答率都是令人失望的。即便如此，對CheckMate 040試驗中患者的進(jìn)一步分析表明，腫瘤PD－L1表達(dá)與OS的改善有關(guān)。

這些臨床試驗的矛盾結(jié)果可能部分是由于PD－L1水平檢測的局限性，包括缺乏評估PD－L1表達(dá)及其時空異質(zhì)性的標(biāo)準(zhǔn)方法，以及缺乏允許確定“過度表達(dá)”的標(biāo)準(zhǔn)閾值。有兩種方法用于定義PD－L1陽性表達(dá)，即PD－L1陽性腫瘤細(xì)胞的比率，即所謂的腫瘤比例評分（TPS），以及PD－L1染色的腫瘤和免疫細(xì)胞的比率，即所謂的聯(lián)合陽性評分（CPS）。KEYNOTE－224 II期試驗使用兩種評分方法對PD－L1進(jìn)行了評估，CPS被證明是更適用的生物標(biāo)記物。此外，PD－L1表達(dá)的預(yù)測值可能被低估，因為它通常在單個時間點進(jìn)行評估，而PD－L1表達(dá)可能是動態(tài)和可誘導(dǎo)的。

腫瘤突變負(fù)荷／微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

腫瘤突變負(fù)荷（TMB）是指單個腫瘤基因組中發(fā)現(xiàn)的非同義突變的數(shù)量，包括DNA損傷反應(yīng)基因和編碼DNA聚合酶ε（POLE）和δ（POLD）催化亞單位的基因改變，并已評估其作為多種腫瘤類型的生物標(biāo)記物的潛力。

一項研究評估了755例HCC患者ICI反應(yīng)的基因組生物標(biāo)記物的頻率，發(fā)現(xiàn)TMB中位數(shù)為4個突變／Mb，只有6例腫瘤（0．8％）發(fā)現(xiàn)高TMB。此外，在一個小樣本病例（N＝17）中，TMB與ICI反應(yīng)無相關(guān)性。然而，與PD－L1表達(dá)的情況一樣，TMB測定缺乏標(biāo)準(zhǔn)化閾值，量化方法也存在差異。因此，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋TMB的臨床價值。

DNA錯配修復(fù)（MMR）是維持基因組完整性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵機制。MMR活性的缺乏導(dǎo)致稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的超突變表型。一項研究評估了pembrolizumab單藥治療86例晚期MMR缺陷型癌癥患者的療效，ORR和完全緩解率（CR）分別為53％和21％，本研究結(jié)果支持MSI可作為實體瘤對PD－1阻斷的臨床反應(yīng)的預(yù)測因子。雖然MSI被認(rèn)為是選擇ICI治療應(yīng)答者的一個指標(biāo)，但仍然缺乏HCC患者的數(shù)據(jù)。Ang等人評估了542例HCC標(biāo)本的MSI，發(fā)現(xiàn)只有一例（0．2％）高M(jìn)SI和高TMB，而其他幾項研究報告中，HCC中MSI的比率也普遍較低。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)MSI可能不是預(yù)測HCC患者ICIs反應(yīng)的理想生物標(biāo)志物。

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞

由于TME內(nèi)的T細(xì)胞浸潤是免疫檢查點阻斷的先決條件，基線腫瘤內(nèi)T細(xì)胞密度和表型已被廣泛研究。CheckMate 040試驗中進(jìn)行的回顧性生物標(biāo)記物分析表明，盡管無統(tǒng)計學(xué)意義，但經(jīng)nivolumab治療的HCC患者中CD3＋或CD8＋腫瘤浸潤性T細(xì)胞數(shù)量的增加與OS改善趨勢相關(guān)。該研究進(jìn)一步表明，CD3＋T細(xì)胞頻率的增加與最佳總體反應(yīng)之間存在關(guān)聯(lián)。

TIL和ICI治療反應(yīng)之間的聯(lián)系也在其他免疫細(xì)胞類型中進(jìn)行了研究。Ng等人分析了49例ICIs治療患者的HCC樣本，并報告腫瘤內(nèi)高CD38＋CD68＋巨噬細(xì)胞的患者與低CD38＋CD68＋巨噬細(xì)胞的患者相比有更好的中位OS（34．43對9．66個月），可能是因為CD38hi巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的IFN－γ以及相關(guān)的細(xì)胞因子。

對從6例HCC患者的外周血、腫瘤組織和鄰近正常組織中分離的5063個T細(xì)胞進(jìn)行深層單細(xì)胞RNA測序。結(jié)果表明，特定亞群，如耗竭的CD8＋T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），在HCC中優(yōu)先富集。

盡管關(guān)注TME中的淋巴細(xì)胞很重要，但將其作為生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床仍然很遙遠(yuǎn)。如何選擇具有特定特征的淋巴細(xì)胞，如何確定陽性標(biāo)準(zhǔn)是許多尚未回答的問題之一。聯(lián)合評估多個免疫細(xì)胞的數(shù)量和PD－L1的表達(dá)以制定TME評分可能是答案之一。

特異性基因改變

近年來，與NGS的出現(xiàn)相關(guān)的分子圖譜提供了關(guān)于可操作靶點的信息，并確定了與ICIs反應(yīng)相關(guān)的特定基因改變。

導(dǎo)致WNT／β－連環(huán)蛋白信號通路激活的CTNNB1基因突變是免疫排斥型HCC（冷腫瘤）的特征，并且與幾種免疫特征的富集分?jǐn)?shù)顯著降低相關(guān)。與WNT野生型HCC相比，在31名接受不同ICI治療的亞組患者中，WNT／β－連環(huán)蛋白通路的激活改變與較低的疾病控制率（0％對53％）、較短的中位PFS（2．0對7．4個月）和較短的中位OS（9．1對15．2個月）相關(guān)。

此外，TP53基因改變是HCC患者中最常見的突變，并且與CTNNB1突變相互排斥。研究表明，TP53的改變與肝癌的免疫微環(huán)境密切相關(guān)，CD8＋T細(xì)胞浸潤較少，F(xiàn)OXP3＋Treg浸潤較多，導(dǎo)致免疫反應(yīng)下調(diào)。

最近的研究表明，免疫相關(guān)長非編碼RNA（lncRNAs）可以預(yù)測肝癌的ICI治療反應(yīng)。Peng等人報道，lncRNA MIR155的宿主基因與肝癌組織中CTLA－4和PD－L1的表達(dá)呈強正相關(guān)，并對ICI治療的療效具有預(yù)測價值。此外，Zhang等人發(fā)現(xiàn)了一種與較差生存率相關(guān)的免疫相關(guān)的lncRNA標(biāo)記，是肝癌患者的獨立預(yù)后生物標(biāo)志物。

一些研究表明，癌細(xì)胞固有的表觀遺傳學(xué)改變與癌變和腫瘤進(jìn)展以及TME的變化有關(guān)，表明其作為免疫治療預(yù)測因子的潛力。此外，鑒于DNA甲基化可以在液體活組織檢查中測量，表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記物可能提供額外的優(yōu)勢。

這些觀察結(jié)果表明，存在特定的基因突變，特別是與CTNNB1、TP53、非編碼RNA和甲基化相關(guān)的基因突變，可能通過與免疫微環(huán)境相互作用影響對ICI治療的反應(yīng)。盡管這些研究仍處于初步階段，但這些改變可能代表肝癌患者選擇的新生物標(biāo)志物。

免疫相關(guān)基因標(biāo)記

最近對腫瘤轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合分析，以表征免疫微環(huán)境對ICI治療的反應(yīng)性。Ayers等人確定了18基因的T細(xì)胞炎癥表達(dá)譜和6基因的IFN－γ標(biāo)記，可預(yù)測多種實體瘤對pembrolizumab治療的反應(yīng)。

CheckMate 040試驗結(jié)果的回顧性分析還包括對4基因炎癥信號（PD－L1、CD8A、LAG3和STAT1）的預(yù)測價值的評估。在劑量遞增和劑量擴展階段，發(fā)現(xiàn)該特征與改善的應(yīng)答和與nivolumab治療相關(guān)的OS相關(guān)。最近，一個5基因免疫相關(guān)標(biāo)記（LDHA、PPAT、BFSP1、NR0B1和PFKFB4）被確定并用于建立肝癌治療反應(yīng)的預(yù)后模型，該模型可以對免疫治療敏感的患者進(jìn)行分層。雖然這些免疫相關(guān)基因標(biāo)記顯示出預(yù)測ICI反應(yīng)的潛力，但這些特征還需要進(jìn)一步的臨床應(yīng)用測試。

外周血生物標(biāo)志物

ICI治療患者腫瘤樣本的持續(xù)可用性對于生物標(biāo)記物研究至關(guān)重要，然而，由于活檢的侵入性，這很難實現(xiàn)。相比之下，循環(huán)生物標(biāo)志物在治療后可以很容易地收集和重復(fù)測量，使其更便于臨床使用。

研究表明，TGF－β在TME內(nèi)的免疫抑制和腫瘤免疫逃避中起著核心作用。在HCC中，TGF－β信號與耗竭的免疫信號之間存在強烈的相關(guān)性。在一項II期試驗中，對29例接受pembrolizumab治療的不可切除肝癌患者的幾種代表性循環(huán)生物標(biāo)志物進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，基線血漿TGF－β水平＜200 pg／mL是更好的OS和PFS的有效預(yù)測因子。

一些可溶性免疫檢查點相關(guān)蛋白最近被證明在各種癌癥類型中具有很好的預(yù)測價值。如PD－L1的外泌體，在一項研究中，循環(huán)外泌體PD－L1水平的增加幅度可以區(qū)分臨床應(yīng)答者和無應(yīng)答者。此外，可溶性PD－L1（sPD－L1）與NSCLC患者的免疫治療反應(yīng)相關(guān)，而關(guān)于HCC患者缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)，需要進(jìn)一步研究。

外周血中的循環(huán)免疫細(xì)胞已被廣泛評估為預(yù)測性生物標(biāo)記物。在tremelimumab對HCC患者與局部區(qū)域治療的聯(lián)合試驗中，發(fā)現(xiàn)在基線檢查時，外周血單個核細(xì)胞中CD4＋PD－1＋細(xì)胞的頻率在對治療有反應(yīng)的患者中高于無反應(yīng)的患者。此外，在16例接受nivolumab治療的肝癌患者中，觀察到基線水平較低的外周血PD－1＋B細(xì)胞陽性和PD－L1＋單核細(xì)胞陽性與疾病控制相關(guān)。

循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）可以預(yù)測幾種腫瘤對ICI治療的反應(yīng)。然而，一項使用ctDNA分析晚期HCC突變情況的研究報告，WNT通路相關(guān)突變與ICI治療后的臨床結(jié)果無關(guān)，表明需要進(jìn)一步研究以確定ctDNA是否確實可以作為HCC的預(yù)測性生物標(biāo)記物。

高甲胎蛋白（AFP）水平被認(rèn)為是肝癌患者臨床預(yù)后不良的一個預(yù)后標(biāo)志物。最近，據(jù)報道，治療后血清AFP水平下降與晚期HCC更好的ICI治療效果有關(guān)。然而，checkmate040臨床試驗的結(jié)果表明，盡管基線AFP＜400?g／L比AFP≥400?g／L與更長的OS相關(guān)，但無論基線AFP水平如何，ORR和DCR相似。鑒于AFP水平與患者的基線特征密切相關(guān)，應(yīng)謹(jǐn)慎解釋其預(yù)測效果。

外周血中的生物標(biāo)記物具有低侵入性的巨大優(yōu)勢，同時大量研究也顯示了其作為免疫治療效果預(yù)測因子的潛力。然而，仍然缺乏來自大樣本臨床試驗的支持性數(shù)據(jù)。此外，目前還沒有證據(jù)表明，對于任何給定的生物標(biāo)記物，血液樣本的預(yù)測準(zhǔn)確性優(yōu)于組織樣本。

腸道微生物

越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物群在先天性和適應(yīng)性免疫的發(fā)展和調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群與ICI治療反應(yīng)之間似乎存在一定的關(guān)系。

Zheng等人最近通過宏基因組測序報告了肝癌抗PD－1免疫治療期間腸道微生物組組成的動態(tài)變化。他們觀察到，與無應(yīng)答者相比，免疫治療應(yīng)答者的糞便樣本顯示出更高的分類豐富度和更多的基因計數(shù)，反應(yīng)組的微生物組成保持相對穩(wěn)定，而無反應(yīng)組的變形菌數(shù)量從第3周開始顯著增加，并在第12周占優(yōu)勢。此外，據(jù)報道，ICI治療開始時使用抗生素與更差的結(jié)果相關(guān)，表明腸道微生物群對HCC治療的影響。目前正在進(jìn)行一項臨床試驗（NCT03785210），以評估聯(lián)合抗生素（萬古霉素）和ICI療法的療效。

IRAE的潛在生物標(biāo)志物

大多數(shù)研究集中于識別預(yù)測免疫治療療效的生物標(biāo)記物，而研究與IRAE相關(guān)的生物標(biāo)記物的研究相對較少。此外，大部分研究結(jié)果來自黑色素瘤患者。然而，這些研究可以作為識別預(yù)測HCC中IRAE的生物標(biāo)志物的參考。

在接受ipilimumab治療的患者中，基線血清IL－6和IL－17水平與嚴(yán)重毒性風(fēng)險增加顯著相關(guān)，其中IL－17與嚴(yán)重腹瀉／結(jié)腸炎相關(guān)。一項涉及167名實體瘤成年患者的回顧性研究表明，在接受nivolumab或pembrolizumab治療的患者中，基線淋巴細(xì)胞計數(shù)增加與IRAE風(fēng)險增加相關(guān)。

未來的研究應(yīng)該探索與ICI療效相關(guān)的潛在生物學(xué)機制，同時如何平衡IRAE的發(fā)病率和免疫治療反應(yīng)也值得認(rèn)真考慮。

小結(jié)

在HCC中，雖然已經(jīng)進(jìn)行了幾項研究以確定預(yù)測性生物標(biāo)記物，但HCC相關(guān)免疫治療仍處于起步階段，探索免疫治療生物標(biāo)記物預(yù)測療效的基礎(chǔ)研究和臨床試驗仍然有限，目前尚不可能確定哪些生物標(biāo)記物可以有效預(yù)測免疫治療的療效。

特別值得注意的是，生物標(biāo)志物在患者群體中經(jīng)歷動態(tài)變化。因此，在治療前和治療期間從患者身上獲取樣本以評估這些動態(tài)變化并正確確定評估生物標(biāo)志物的預(yù)測價值至關(guān)重要，同時應(yīng)充分考慮其在臨床實踐中的應(yīng)用。NGS、單細(xì)胞RNA測序和人工智能等研究技術(shù)的發(fā)展將使我們更全面地了解TME的各種成分及其相互作用，并且可以在基因組尺度上廣泛篩選潛在的生物標(biāo)記物，以確定治療效果的預(yù)測因子。

參考文獻(xiàn)：

1．Biomarkers and Future Perspectives forHepatocellular Carcinoma Immunotherapy． Front Oncol． 2021； 11： 716844．