連接子不僅是抗體與小分子有效載荷之間形成共價(jià)連接的分子部分,而且是靶向藥物治療中具有設(shè)計(jì)性質(zhì)的關(guān)鍵元件。連接子的加入不應(yīng)誘導(dǎo)聚集,并且需要確�？山邮艿腜K特性,同時(shí)限制有效載荷在血漿中的過(guò)早釋放(穩(wěn)定性),并使活性分子在靶向作用位點(diǎn)有效釋放。連接子分為兩類(lèi):不可切割型和可切割型。

不可切割連接子

基于不可切割的連接子的ADC必須被內(nèi)化,抗體部分需要被溶酶體蛋白酶降解以釋放活性分子。在ADC開(kāi)發(fā)過(guò)程中已經(jīng)探索了許多不可切割的連接子,最具代表性的是N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鹽(SMCC),Kadcyla就是使用的此類(lèi)型連接子。

這種結(jié)構(gòu)的分解代謝導(dǎo)致Lys-SMC-DM1成為主要的腫瘤代謝物。此外,與這種連接子相連的藥物通常不能發(fā)揮旁觀者效應(yīng),因?yàn)獒尫诺姆纸獯�謝產(chǎn)物通透性較差。目前的研究主要集中在可切割的連接子上。

使用可切割連接子對(duì)于具內(nèi)化和不具內(nèi)化ADC的設(shè)計(jì)同樣可行,因?yàn)獒尫攀怯汕懈钗稽c(diǎn)(溶酶體和/或腫瘤環(huán)境)的性質(zhì)觸發(fā)的。連接子可以分為兩大類(lèi):酶依賴性和化學(xué)(即非酶)依賴性。

化學(xué)依賴性連接子

含有二硫鍵的連接子受到硫醇的親核攻擊以釋放活性載荷。盡管血漿中人血清白蛋白(HSA)的還原形式就是最豐富的硫醇,但它對(duì)大分子的反應(yīng)性很差。胞漿中還含有高水平的谷胱甘肽(GSH),這是一種含有巰基的三肽,很容易與S-親核蛋白發(fā)生反應(yīng)。血液(微摩爾范圍)和細(xì)胞質(zhì)(毫摩爾范圍)中GSH濃度的差異以及癌細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激有助于藥物在癌細(xì)胞內(nèi)的優(yōu)先釋放。含有二硫鍵的連接子主要與maytansinoid類(lèi)有效載荷相關(guān)。二硫鍵的反應(yīng)性可由空間位阻調(diào)節(jié):α-甲基替換顯著影響還原速率和對(duì)硫醇-二硫鍵交換的抗性,如SAR-3419的連接子通過(guò)偕二甲基替換獲得SPDB-DM4最佳的抗腫瘤活性。

腙連接子顯示出依賴于pH的穩(wěn)定性,在中性pH下穩(wěn)定,并在酸性介質(zhì)中水解(內(nèi)體的pH<6,溶酶體的pH<5),形成相應(yīng)的酮和肼。

該方法已成功應(yīng)用于IMMU-110,包含一個(gè)可裂解�；�腙連接子,由4-馬來(lái)酰亞胺甲基環(huán)己烷-1-羧酸鹽(MCC)的酰肼與阿霉素中存在的酮基反應(yīng)中形成。

腙連接體也經(jīng)常用于卡利霉素家族的有效載荷,在這種情況下,釋放是由兩步活化過(guò)程觸發(fā)的:第一步酸敏感腙被水解,第二步二硫鍵被GSH還原,使巰基中間體環(huán)化。這種連接子已經(jīng)在上市的Mylotarg和Besponsa中使用,但是它們?cè)谘獫{中的穩(wěn)定性不如預(yù)期,也不如其他可切割連接子吸引人。

酶依賴性連接子

為了限制有效載荷在內(nèi)化前的釋放,從而防止或最小化目標(biāo)細(xì)胞外的降解,溶酶體的蛋白質(zhì)組分成為尋找能夠降解ADC并以高濃度存在的酶的合理場(chǎng)所。

組織蛋白酶-B

組織蛋白酶B是一種半胱氨酸蛋白酶,存在于哺乳動(dòng)物的晚期內(nèi)體和溶酶體中,在許多癌細(xì)胞中也過(guò)度表達(dá)。最初,一種可切割的二肽作為組織蛋白酶B的底物用作阿霉素前藥,這項(xiàng)工作建立了SAR的二肽部分:P1位置需要親水性殘基(瓜氨酸或精氨酸),而P2位置的親脂性殘基增強(qiáng)血漿穩(wěn)定性(苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸)。

此外,還引入了一個(gè)自降解間隔子來(lái)促進(jìn)酶的進(jìn)入,從而限制了有效載荷的空間位阻:對(duì)氨基芐基氨基甲酸酯(PABA)在酸性介質(zhì)中自發(fā)1,6-消除,釋放二氧化碳、對(duì)氮雜醌甲酰胺和阿霉素。最終,這一發(fā)現(xiàn)從前藥轉(zhuǎn)移到ADC領(lǐng)域,證明了Val-Cit和Phe-Lys二肽連接子的抗原驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞活性。

Val-Cit二肽是ADCs中最常用的可裂解連接子,目前有多達(dá)25個(gè)分子處于臨床階段,可能是因?yàn)槠湔�體良好的血漿穩(wěn)定性、釋放行為和化學(xué)可牽引性。兩個(gè)已獲批的ADC藥物(Adcetris和Polivy) 都使用了相同的連接子mc-VC-PABC,其中包含馬來(lái)酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標(biāo)準(zhǔn)Val Cit二肽序列和PABC自降解間隔子。

Val-Ala二肽也被廣泛應(yīng)用,有7個(gè)分子處于臨床階段,進(jìn)展最快的是Loncastuximab tesirine,其包括一個(gè)聚乙二醇化間隔子,以平衡屬于PBD二聚體家族的有效載荷SG3199的親脂性。

研究表明,由于沉淀和聚集,Val-Cit很難實(shí)現(xiàn)高DAR。相反,Val-Ala連接子允許DAR高達(dá)7．4,且聚集有限(<10%)。與Val-Cit相比,Val-Ala的疏水性較低,這解釋了為什么這種連接子在親脂性的有效載荷(如PBD二聚體)方面表現(xiàn)卓越,7個(gè)臨床候選ADC的Val-Ala連接子都連接PBD。

一些研究將Val-Cit和Val-Ala二肽結(jié)構(gòu)與MMAE的有效載荷連接進(jìn)行了比較。在非內(nèi)化抗體的情況下,結(jié)合到工程化半胱氨酸的Val-Cit和Val-Ala連接子都表現(xiàn)出類(lèi)似的特征,并且比Val-Lys和Val-Arg類(lèi)似物表現(xiàn)出更好的性能。在使用隨機(jī)半胱氨酸結(jié)合的抗Her2 ADC的情況下,與Val-Cit相比,Val-Ala在高DAR結(jié)構(gòu)中顯示出較少的聚集性。另一方面,兩種連接子顯示出相似的緩沖穩(wěn)定性、組織蛋白酶B釋放效率、細(xì)胞活性和組織病理學(xué)特征。

四肽Gly-Gly-Phe-Gly顯示出穩(wěn)定和有效的可切割連接子的所有特性,已上市的ADC藥物Enhertu使用了此類(lèi)連接子。第一三共的Enhertu是一種血漿穩(wěn)定的ADC,DAR為7．7,在溶酶體中發(fā)生蛋白酶降解,釋放DX-8951f,這是一種有效的拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑,來(lái)源于exatecan。由于連接子不含增溶劑,達(dá)到如此高的DAR是非�？捎^的,因?yàn)樗�與廣泛確立的原理相矛盾,即高DAR結(jié)合物可能具有較差的藥代動(dòng)力學(xué)特征。這里使用的自降解間隔子是簡(jiǎn)單和緊湊的半胺化,而不是Val-Cit連接子使用的PABC。

磷酸酶和焦磷酸酶

與組織蛋白酶一樣,焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶體中選擇性表達(dá)的水解酶。2016年,默克公司的研究人員設(shè)計(jì)了含有磷酸和焦磷酸的連接子與組織蛋白酶B敏感的Val-Cit-PABA搭配,旨在傳遞糖皮質(zhì)激素:磷酸鹽/焦磷酸鹽部分結(jié)合在自降解間隔子PABA和有效載荷之間。內(nèi)化后,有效載荷可通過(guò)組織蛋白酶B、自降解間隔子和磷酸酶(n=1)的順序釋放。對(duì)于焦磷酸酯(n=2),可能需要另一個(gè)涉及焦磷酸酶的步驟。

這種親水性和永久性帶電基團(tuán)的優(yōu)點(diǎn)是溶解性,不僅能夠與親脂性糖皮質(zhì)激素衍生物進(jìn)行生物偶聯(lián),而且促進(jìn)ADC純化, ADC中的殘余連接子少于0．10%。含有磷酸和焦磷酸的ADC在體外都具有活性。

默克公司的同一組研究人員還開(kāi)發(fā)了一種獨(dú)特的基于焦磷酸酶的連接子,用于釋放含羥基有效載荷地塞米松和丙酸氟替卡松。

此外,羥基附著點(diǎn)的性質(zhì)對(duì)有效釋放至關(guān)重要。地塞米松的伯醇效果良好,而更受阻的氟替卡松的仲醇需要一個(gè)縮醛間隔子,從而實(shí)現(xiàn)可接受的釋放。兩種ADC在體外均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性,對(duì)腫瘤細(xì)胞系具有較強(qiáng)的活性。

β-葡萄糖醛酸酶

β-葡萄糖醛酸酶是一類(lèi)糖苷酶,催化β-葡萄糖醛酸殘基的水解,它在溶酶體和腫瘤間質(zhì)中高表達(dá)。西雅圖遺傳學(xué)的研究人員于2006年發(fā)表了一項(xiàng)開(kāi)創(chuàng)性的工作,抗CD70 ADC使用了含葡萄糖醛酸的連接子,葡萄糖醛酸附著在自降解間隔子上。這種連接子表現(xiàn)出低水平的聚集、高血漿穩(wěn)定性、以及強(qiáng)大的體內(nèi)功效。

該連接子還通過(guò)一個(gè)額外的二甲基乙二胺(DMED)自降解間隔子應(yīng)用于其他含胺的有效載荷,如喜樹(shù)堿類(lèi)似物、SN38、杜卡霉素和苦參堿。釋放順序從水解β-葡萄糖醛酸到自降解間隔子,DMED的另一個(gè)環(huán)化反應(yīng)自發(fā)發(fā)生,形成1,3-二甲基咪唑啉-2-酮,并最終釋放含羥基藥物。由于連接子的親水性,與組織蛋白酶敏感連接子相比,該技術(shù)使ADC的DAR=8制備更為容易。

β-半乳糖苷酶

最近報(bào)道了一種使用β-半乳糖苷酶裂解連接子的ADC,其中包含PEG10間隔子。間隔子被硝基取代,以提高自降解速率。類(lèi)比β-葡萄糖醛酸酶連接子,其解離機(jī)制涉及水解β-半乳糖苷酶部分,它賦予化學(xué)前體親水性。另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是β-半乳糖苷酶僅存在于溶酶體中,而β-葡萄糖醛酸酶在溶酶體中表達(dá),也在實(shí)體瘤的微環(huán)境中表達(dá)。研究證明,在抗HER2-ADCs釋放MMAE的背景下,含β-半乳糖苷酶連接子的 ADC在體外和體內(nèi)均比T-DM1更為有效。

硫酸酯酶

最近,出現(xiàn)了硫酸酯酶裂解的連接子,硫酸酯酶在幾種癌癥類(lèi)型中過(guò)度表達(dá),表現(xiàn)出潛在的選擇性。研究涉及以MMAE為有效載荷的抗Her2抗體,與經(jīng)典的可切割Val-Cit和Val-Ala連接子相比,硫酸酯酶連接子對(duì)Her2+細(xì)胞系顯示出相似的效力。

參考文獻(xiàn):

1．The Chemistry Behind ADCs． Pharmaceuticals (Basel)． 2021 May; 14(5): 442．