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前言

由于有效載荷、連接子和偶聯(lián)方法的改進，抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的發(fā)展在過去十年中取得了顯著進展。特別是，連接子設計在調節(jié)ADC在體循環(huán)中的穩(wěn)定性和腫瘤中的有效載荷釋放效率方面起著關鍵作用，從而影響ADC的藥代動力學（PK）、療效和毒性特征。

一些關鍵的連接子參數(shù)，如偶聯(lián)化學、連接子長度和連接子空間位阻都會對ADC藥物的PK和功效產生影響。理想的連接子應在循環(huán)系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，并在腫瘤中釋放細胞毒性有效載荷。然而，現(xiàn)有的連接子通常會非特定地釋放有效載荷，并不可避免地導致脫靶毒性。

因此，在ADC藥物的設計中，正確調整連接子的這些重要參數(shù)，從而實現(xiàn)ADC穩(wěn)定性和有效載荷釋放效率之間的平衡，才能達到ADC藥物預期的效果。在過去幾年中，人們開發(fā)了許多新的連接子，包括組織蛋白酶可切割連接子、酸可切割連接子、GSH可切割連接子、Fe（II）可切割連接子、新型酶可切割連接子、光響應可切割連接子和生物正交可切割連接子。其中，組織蛋白酶、GSH和酸可切割連接子已被充分研究并應用于經批準的ADC中。連接子設計取得了許多重要進展，這些工作將有助于指明連接子未來的發(fā)展方向。

組織蛋白酶可切割連接子

2017年，Caculitan等人發(fā)現(xiàn)纈氨酸瓜氨酸（Val－Cit）連接子對多種組織蛋白酶表現(xiàn)出廣泛的敏感性，包括組織蛋白酶B、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L等。為了提高選擇性，Wei等人設計了一種使用環(huán)丁烷－1，1－二甲酰胺（cBu）結構的連接子，該結構主要依賴于組織蛋白酶B。

在細胞內，組織蛋白酶B抑制劑能夠有效地抑制（超過75％）含cBu－Cit連接子的藥物釋放，而組織蛋白酶K抑制劑沒有顯著的效果。相反，傳統(tǒng)的含Val－Cit的連接子似乎對所有單一蛋白酶抑制劑耐受（組織蛋白酶B、L和K的抑制劑均小于15％）。同時，與含有Val－Cit連接子的ADC相比，含有cBu－Cit連接子的ADC在體外表現(xiàn)出更大的腫瘤抑制作用。

此外，肽連接子的優(yōu)化不僅限于開發(fā)新的結構，肽連接子可以通過最小的結構變化進行優(yōu)化，如氨基酸的類型和結構化學。一些研究將Val－Cit和Val－Ala二肽結構與MMAE的有效載荷連接進行了比較。在非內化抗體的情況下，結合到工程化半胱氨酸的Val－Cit和Val－Ala連接子都表現(xiàn)出類似的特征，并且比Val－Lys和Val－Arg類似物表現(xiàn)出更好的性能。在使用隨機半胱氨酸結合的抗Her2 ADC的情況下，與Val－Cit相比，Val－Ala在高DAR結構中顯示出較少的聚集性。另一方面，兩種連接子顯示出相似的緩沖穩(wěn)定性、組織蛋白酶B釋放效率、細胞活性和組織病理學特征。

四肽Gly－Gly－Phe－Gly顯示出穩(wěn)定和有效的可切割連接子的所有特性，已上市的ADC藥物Enhertu使用了此類連接子。第一三共的Enhertu是一種血漿穩(wěn)定的ADC，DAR為7．7，在溶酶體中發(fā)生蛋白酶降解，釋放DX－8951f，這是一種有效的拓撲異構酶I抑制劑，來源于exatecan。由于連接子不含增溶劑，達到如此高的DAR是非常可觀的，因為它與廣泛確立的原理相矛盾，即高DAR結合物可能具有較差的藥代動力學特征。這里使用的自降解間隔子是簡單和緊湊的半胺化，而不是Val－Cit連接子使用的PABC。

酸可切割連接子

酸切割連接子利用腫瘤組織（4．0–5．0）和血漿之間的pH差（?7．4）選擇性地向腫瘤組織釋放有效載荷。這種策略在Mylotarg獲得了最早的臨床成功，后來也在Besponsa中得到應用。然而，酸切割連接子的穩(wěn)定性不足嚴重限制了其在ADC中的應用，苯酮衍生的腙連接子在人和小鼠血漿中以2天的半衰期水解，Sacituzumab－govitecan（Trodelvy）的血清穩(wěn)定性也不令人滿意，其半衰期為36小時。

因此，酸裂解ADC需要更穩(wěn)定的連接子，或者只能使用中度細胞毒性的有效載荷。2019年，一種新型的硅醚基酸裂解ADC被開發(fā)出來，攜帶高細胞毒性的單甲基auristatin E（MMAE）。這種設計極大地提高了酸裂解連接子的穩(wěn)定性，此外，這種使用新型硅醚連接子的ADC在人血漿中的半衰期超過7天，并且在小鼠異種移植模型中顯示出良好的治療效果。

GSH可切割連接子

與血漿（?5μmol／L）中相比，GSH切割的連接子依賴于細胞質中較高水平的谷胱甘肽（1–10 mmol／L）。二硫鍵在這些連接子中最常用，然而，目前的二硫鍵結構無法實現(xiàn)高循環(huán)穩(wěn)定性和高效細胞內釋放的完美結合。

2017年，Thomas等人試圖通過將小分子藥物直接連接到硫單抗中的工程化半胱氨酸來解決這個問題。通過直接連接抗體，抗體的空間保護將提高循環(huán)穩(wěn)定性。

體內穩(wěn)定性研究表明，當DM1通過二硫鍵連接到單抗的K149C上時，超過50％的藥物即使在七天后仍保持連接。體內藥效研究表明，在人類淋巴瘤－腫瘤異種移植小鼠模型中，這種新型抗CD22－DM1－ADC可誘導腫瘤消退。

同年，這種新策略被用于PBD作為有效載荷的ADC。與馬來酰亞胺肽（Val－Cit）－PBD－ADC相比，在人類非霍奇金淋巴瘤異種移植小鼠模型中，新型二硫鍵的ADC表現(xiàn)出類似的活性。同時，這種新型二硫鍵ADC的MTD高于Val－Cit ADC（10 vs2．5 mg／kg）。

Fe（II）可切割連接子

鐵代謝異�？商岣哂坞x亞鐵的水平，基于這一策略，增加未結合的亞鐵濃度已用于前藥設計。2018年，Spangler等人報告了一種Fe（II）反應性1，2，4－三氧烷骨架的（TRX）連接子，并將這種連接子用于ADC。

通過TRX和Fe（II）的O–O鍵之間的Fenton反應裂解連接子，提供羰基中間體并通過β－消除釋放有效載荷。

在體外細胞毒性研究中，含有TRX連接子的ADC在抗原陽性細胞中的活性與含有Val－Cit連接子的經典ADC相似。然而，在抗原陰性的MDA－MB－468細胞系中，含有TRX連接子的ADC仍然顯示出顯著的毒性。這種不穩(wěn)定性是由金剛烷部分和抗體上附近位點之間的非特異性相互作用引起的。

新型的酶可切割連接子

與組織蛋白酶一樣，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶體中選擇性表達的水解酶。2016年，默克公司的研究人員設計了含有磷酸和焦磷酸的連接子與組織蛋白酶B敏感的Val－Cit－PABA搭配，旨在傳遞糖皮質激素。這種親水性和永久性帶電基團的優(yōu)點是溶解性，不僅能夠與親脂性糖皮質激素衍生物進行生物偶聯(lián)，而且促進ADC純化， ADC中的殘余連接子少于0．10％。含有磷酸和焦磷酸的ADC在體外都具有活性。

默克公司的同一組研究人員還開發(fā)了一種獨特的基于焦磷酸酶的連接子，用于釋放含羥基有效載荷地塞米松和丙酸氟替卡松。

兩種ADC在體外均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，對腫瘤細胞系具有較強的活性。

除了2006年為ADC開發(fā)的經典β－葡萄糖醛酸酶可切割連接子外，還發(fā)現(xiàn)β－半乳糖苷酶在腫瘤細胞中過度表達并具有水解活性。最近報道了一種使用β－半乳糖苷酶裂解連接子的ADC，其中包含PEG10間隔子。間隔子被硝基取代，以提高自降解速率。類比β－葡萄糖醛酸酶連接子，其解離機制涉及水解β－半乳糖苷酶部分，它賦予化學前體親水性。另一個優(yōu)勢是β－半乳糖苷酶僅存在于溶酶體中，而β－葡萄糖醛酸酶在溶酶體中表達，也在實體瘤的微環(huán)境中表達。研究證明，在抗HER2－ADCs釋放MMAE的背景下，含β－半乳糖苷酶連接子的 ADC在體外和體內均比T－DM1更為有效。

最近，還出現(xiàn)了硫酸酯酶裂解的連接子，硫酸酯酶在幾種癌癥類型中過度表達，表現(xiàn)出潛在的選擇性。研究涉及以MMAE為有效載荷的抗Her2抗體，與經典的可切割Val－Cit和Val－Ala連接子相比，硫酸酯酶連接子對Her2＋細胞系顯示出相似的效力。

光響應可切割連接子

近年來，基于光響應切割的有效載荷釋放策略逐漸出現(xiàn)。光響應可切割具有以下優(yōu)點，包括低毒性、快速反應、高靈敏度和特異性。

2015年，Nani等人首次對ADC采用近紅外（NIR）光照鎖定策略。光響應切割基于七甲川菁熒光團骨架。在用NIR光（λ＝650–900nm）照射后，ADC以位點特異性方式在受照腫瘤區(qū)域有效釋放小分子細胞毒素CA－4。

在體外細胞毒性實驗中，含有NIR光裂解連接子的ADC在EGFR＋細胞系中經輻射后表現(xiàn)出相當于CA－4的活性，而未經輻射時表現(xiàn)出低活性。然而，這種連接子的自聚集和光不穩(wěn)定特性限制了其作為藥物的進一步開發(fā)應用。

最近，有研究報告了一種新型的紫外（UV）光控ADC。連接子引入了紫外光控制的鄰硝基芐基作為切割觸發(fā)。在穩(wěn)定性和釋放研究中，這種含有MMAE的連接子在自然光下6天內釋放＜1％，在輻照后10分鐘內顯示MMAE的快速釋放，并達到最高平臺。在體外細胞毒性實驗中，用365nm（40W）紫外光照射后，含有鄰硝基芐基連接子的ADC的活性顯著增加，比未經照射的ADC高50倍。

2019年，報道了一種光響應、自斷裂的連接子，使用光籠C40氧化堿性位點（PC4AP）。與前面提到的兩個ADC相比，這種連接子在設計上具有“雙重保險”。在365 nm輻射下，PC4AP的羥基與其自身抗體上附近的胺發(fā)生分子內加成反應，隨后的消除反應導致裂解和有效載荷釋放。含有肽－PC4AP－DOX的ADC在陽性細胞中顯示出與有效載荷DOX相當?shù)亩拘�，并且在沒有輻射的情況下沒有細胞毒性。

生物正交可切割連接子

生物正交化學具有選擇性高、加工快速簡便、副產物無毒等特點。2019年，Wang等人開發(fā)了一種生物正交可切割連接子，該連接器使用了經典的生物正交切割對Cu（I）－BTTAA和dsProc。

然而，生物正交可切割連接子目前主要集中在體外探索上。在反應效率、反應速率、底物穩(wěn)定性、生物相容性和操作方便性方面仍存在問題，離臨床應用還很遠。

小結

在過去的幾年里，ADC的結構優(yōu)化和機制擴展方面取得了許多進展。新的可切割連接子已經被開發(fā)出來，以獲得對腫瘤的更高選擇性。尤其新型光響應可切割連接子和生物正交可切割連接子可以打破傳統(tǒng)ADC的細胞內藥物釋放限制。這些新型連接子的初步數(shù)據(jù)令人鼓舞，未來將極大地促進ADC藥物的迅猛發(fā)展。

參考文獻：

1．The Chemistry Behind ADCs． Pharmaceuticals （Basel）． 2021 May； 14（5）： 442．

2． Antibody－drugconjugates： Recent advances in linker chemistry． Acta Pharm Sin B． 2021Dec；11（12）：3889－3907．

       原文標題 : ADC連接子的最新研究進展