mRNA疫苗在感染性疾病的研究進展

以mRNA為基礎(chǔ)的治療代表了一個相對新穎和高效的藥物類別。最近發(fā)表的幾項研究強調(diào)了mRNA疫苗在治療不同類型的惡性腫瘤和傳染病方面的潛在療效，這些疾病中傳統(tǒng)的疫苗策略不能引起保護性免疫反應(yīng)。

截至2019年底，15種針對傳染病的候選mRNA疫苗已進入臨床試驗，當(dāng)時，人們認(rèn)為mRNA疫苗至少還需要5－6年才能獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。但是，當(dāng)2020年初COVID－19大流行橫行世界時，這些期望就被顛覆了。在接下來的幾個月里，mRNA疫苗的研發(fā)、制造和部署都進入了飛速跨越的階段。

SARS－CoV－2疫苗

大多數(shù)SARS－CoV－2候選疫苗對病毒表面的棘突蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)。棘突蛋白與其宿主細(xì)胞表面的受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2結(jié)合。然后，細(xì)胞的跨膜絲氨酸蛋白酶2將附著的棘突蛋白切開，該蛋白酶誘導(dǎo)構(gòu)象變化，暴露棘突蛋白的融合肽并促進與細(xì)胞或內(nèi)體膜的融合。通常，疫苗mRNA編碼的抗原要么是全長棘突蛋白，要么是棘突蛋白的受體結(jié)合域。

截至2021年6月18日，185個CVID－19疫苗候選處于臨床前開發(fā)階段，另外102個已進入臨床試驗。在臨床試驗中，19種為mRNA疫苗。2020年12月11日，輝瑞的BNT162b2疫苗獲得了FDA的緊急授權(quán)，成為第一個獲準(zhǔn)用于人體的mRNA藥物。一周后，Moderna疫苗mRNA－1273也被授權(quán)在美國使用。最終，它們是第一批在美國、英國、加拿大和其他幾個國家獲得授權(quán)的SARS－CoV－2疫苗。

輝瑞和BioNTech共同開發(fā)了五種mRNA候選疫苗，它們編碼棘突蛋白抗原的變體。兩個主要候選藥物BNT162b1和BNT162b2使用Acuitas Therapeutics的可電離脂質(zhì)ALC－0315和核苷修飾的mRNA，其中所有尿苷被N1甲基假尿苷取代，以增強mRNA翻譯。BNT162b1編碼三聚體分泌型棘突蛋白的受體結(jié)合域，而BNT162b2編碼全長SARS－CoV－2棘突糖蛋白，S2亞基中有兩個脯氨酸替換，將蛋白鎖定在融合前構(gòu)象。

在兩種疫苗的第一階段試驗中，都可誘導(dǎo)高滴度的中和抗體，并產(chǎn)生強烈的CD4＋和CD8＋反應(yīng)，伴有輕度至中度不良反應(yīng)。兩種候選疫苗耐受性良好且有效，但只有BNT162b2疫苗因其較輕的全身和局部不良反應(yīng)而進入II／III期試驗。在第三階段試驗中，BNT162B2顯示了95％的整體預(yù)防和90～100％的療效。

Moderna與國立衛(wèi)生研究院合作開發(fā)了mRNA－1273。該疫苗使用了可電離脂質(zhì)SM－102制備LNP，該LNP封裝N1甲基假尿苷修飾的mRNA。該序列編碼SARS－CoV－2棘突蛋白，帶有兩個脯氨酸替換，賦予融合前構(gòu)象。

在1期臨床試驗中， mRNA－1273非常有效且耐受性良好。在涉及30420名志愿者的III期試驗中，兩支100μg劑量疫苗的預(yù)防率為94．1％，注射部位的局部疼痛是最常見的副作用。第二次給藥后，一半的志愿者報告了中度至重度系統(tǒng)性副作用（例如疲勞、肌肉疼痛、關(guān)節(jié)疼痛），這些副作用在48小時內(nèi)消失。

盡管輝瑞和Moderna公司生產(chǎn)的疫苗已證明具有良好的療效和安全性，但它們對冷鏈儲存的需求帶來了保障的巨大困難。mRNA－1273可在4－8℃下儲存持續(xù)一個月，而BNT162b2則需要在－60℃條件下儲存。

CureVac的候選疫苗CVnCoV在5℃下可穩(wěn)定儲存3個月。CVnCoV使用Acuitas Therapeutics（可能是ALC－0315）的可電離脂質(zhì)和編碼具有兩個脯氨酸替代物的全長棘突蛋白的未修飾mRNA。在第一階段臨床試驗中，志愿者產(chǎn)生的中和抗體與CVID－19恢復(fù)期患者相似，耐受性良好。然而不幸的是，在包括4萬人的III期臨床試驗中，CVnCoV僅顯示出47％的療效。中期分析表明，CVnCoV的較低療效歸因于新出現(xiàn)的SARS－CoV－2變異。

目前，CureVac正與GSK合作，開發(fā)第二代候選藥物——CV2CoV，該藥物經(jīng)過優(yōu)化，以增強相對于CVnCoV的翻譯和免疫原性。CV2CoV使用來自人類羥基類固醇17－β－脫氫酶4基因的5′UTR和來自人類蛋白酶體20S亞單位β3基因的3′UTR。在臨床前研究中，CV2CoV在體外顯示出比CVnCoV高1．8倍的蛋白表達(dá)，并在大鼠中誘導(dǎo)針對B．1．1．7、B．1．1．298和B．1．351變體的高滴度交叉中和抗體。

另一種耐熱候選疫苗ARCoV由中國人民解放軍軍事科學(xué)院與Walvax生物技術(shù)公司合作開發(fā)，可以在25℃穩(wěn)定一周。ARCoV編碼棘突蛋白的受體結(jié)合域。在臨床前研究中，在食蟹猴中可誘導(dǎo)高SARS－CoV－2特異性IgG抗體和強病毒中和滴度。盡管CVnCoV和ARCoV熱穩(wěn)定性背后的原因尚不清楚，但mRNA二級結(jié)構(gòu)、較小的mRNA大小、GC含量和脂質(zhì)可能是重要因素。

其它一些mRNA候選疫苗也正在研制中。LNP－nCoVsaRNA由倫敦帝國理工學(xué)院和Acuitas Therapeutics合作開發(fā)，編碼全長棘突蛋白。目前，正在使用0．1–1?g劑量遞增方案進行I期臨床試驗評估（ISRCTN17072692），其使用了所有候選mRNA疫苗中最低的RNA劑量。

另一種自擴增mRNA疫苗候選物ARCT－021（也稱為LUNAR－COV19）由Arcturus公司利用其專有的LUNAR脂質(zhì)載體和自轉(zhuǎn)錄和復(fù)制RNA（STARR）平臺開發(fā)。它編碼全長融合前棘突蛋白。

流感病毒疫苗

全世界每年約有29萬至65萬人死于流感病毒。目前的疫苗以促進病毒進入的病毒血凝素蛋白為靶標(biāo)。傳統(tǒng)的流感疫苗是生長在雞蛋中的滅活流感病毒，生產(chǎn)時間長，純化困難。此外，病毒會在雞蛋中發(fā)生變異以獲得最佳生長，有時會使它們在人類中無效。

因此，確實需要替代的抗原靶點和生產(chǎn)方法。體外轉(zhuǎn)錄的合成mRNAs可以滿足這一需求，并確保在出現(xiàn)全新流感毒株時快速生產(chǎn)疫苗。例如，2013年，基于LNP（DLinDMA）的自我擴增mRNA疫苗在中國H7N9爆發(fā)后8天內(nèi)迅速研制成功，然而不幸的是，由于當(dāng)時沒有用于mRNA制造的GMP設(shè)施，未能進行臨床試驗。

也有人致力于研制一種不需要每年修改的通用流感疫苗。這種疫苗可以對幾種流感病毒株和亞型產(chǎn)生免疫力。在2012年首次展示的流感mRNA疫苗，三次皮內(nèi)注射在小鼠中分別誘導(dǎo)針對H1N1和H5N1毒株的同源和異源免疫。

值得注意的是，不易發(fā)生突變的血凝素保守柄區(qū)最近已成為一種新型通用疫苗靶標(biāo)。還有另一項研究使用LNPs來遞送50ng劑量的mRNA，編碼三種保守的流感蛋白：神經(jīng)氨酸酶、核蛋白和基質(zhì)－2離子通道蛋白以及血凝素柄區(qū)。令人難以置信的是，這種微小的mRNA劑量產(chǎn)生了廣泛的保護性抗體。

寨卡病毒疫苗

寨卡病毒感染于1947年首次被發(fā)現(xiàn)，感染寨卡病毒的患者通常無癥狀或出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹和肌肉疼痛等輕微癥狀。然而，寨卡病毒在2015－2016年美洲流行期間成為全球健康危機，該病毒在懷孕期間導(dǎo)致嚴(yán)重胎兒神經(jīng)畸形和胎兒死亡。膜和包膜蛋白（prM－E）是針對寨卡病毒的mRNA疫苗常見的抗原選擇，因為針對prM－E的中和抗體可以防止病毒融合。

Moderna與華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院合作，開發(fā)了一種改良的prM－E mRNA，其中包含E蛋白中的突變?nèi)诤檄h(huán)形表位。兩個10?g劑量的mRNA可保護小鼠免受寨卡病毒攻擊，并減少登革熱增強抗體的產(chǎn)生。這些令人鼓舞的臨床前結(jié)果促進了I期試驗的進行，中期結(jié)果表明，疫苗mRNA－1893在10天內(nèi)誘導(dǎo)94－100％的血清轉(zhuǎn)陽，耐受性良好。

此外，另一項研究使用被動免疫方法，利用基于角鯊烯的納米載體遞送編碼ZIKV中和抗體的mRNA。對于免疫系統(tǒng)受損而無法合成自身抗體的免疫缺陷患者來說，這是一種很有吸引力的方法。

HIV病毒疫苗

全球范圍內(nèi)，艾滋病毒目前影響3800萬人，預(yù)計到2030年將影響多達(dá)4200萬人。盡管已進行了30年的研究，但尚未開發(fā)出有效的疫苗，這主要是因為HIV包膜蛋白具有顯著的抗原性多樣性以及隱藏關(guān)鍵包膜蛋白表位“聚糖屏障”。幾項臨床前研究已經(jīng)使用了多種載體，包括陽離子納米乳劑、DOTAP／DOPE脂質(zhì)體、Polymers和可電離LNP，它們在不同程度看到了一些效果。這些研究表明，除了有效的載體外，新的抗原對于有效地靶向HIV是非常關(guān)鍵的。

呼吸道合胞病毒疫苗

呼吸道合胞病毒是全球急性下呼吸道感染的主要原因。每年，估計有60000名5歲以下兒童死亡，超過14000名65歲以上的人死亡。

目前的RSV候選疫苗主要針對高度保守的F蛋白。盡管一些候選者由于中和抗體滴度不足而未能通過臨床試驗，但對F蛋白構(gòu)象的新發(fā)現(xiàn)表明，針對融合前構(gòu)象接種疫苗可產(chǎn)生優(yōu)異的中和抗體反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)有望改進未來的疫苗設(shè)計。

Moderna正在評估編碼融合前F蛋白的三種單劑量候選疫苗：mRNA－1172和mRNA－1777用于成人，以及mRNA－1345用于兒童。在I期臨床試驗中，mRNA－1777誘導(dǎo)RSV中和抗體產(chǎn)生強烈的體液反應(yīng)，CD4＋T細(xì)胞對RSV F蛋白產(chǎn)生反應(yīng)，且無嚴(yán)重不良事件。mRNA－1345的序列已被進一步設(shè)計和密碼子優(yōu)化，以增強相對于mRNA－1777的翻譯和免疫原性。接種后1個月，mRNA－1345產(chǎn)生的中和抗體滴度約為mRNA－1777的八倍。最終，Moderna的目標(biāo)是將mRNA－1345與其兒科人類偏肺病毒／副流感病毒3型（hMPV／PIV3）候選疫苗mRNA－1653整合，并用單一配方為兒童接種針對三種不同病原體的疫苗。

埃博拉病毒疫苗

埃博拉病毒（EBOV）于1976年首次被確定為導(dǎo)致埃博拉病爆發(fā)的病原體。這種病毒性出血熱在2014－2016年西非埃博拉疫情中奪走了11000多條生命。2019年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了一種基于重組水泡性口炎病毒（VSV）的埃博拉疫苗（rVSV－EBOV）。盡管與未接種疫苗相比，rVSV－EBOV在預(yù)防埃博拉傳播方面的有效性為97．5％，但臨床試驗注意到一些安全問題（例如急性關(guān)節(jié)炎和皮疹）。

抗EBOV的mRNA疫苗可能比這種基于病毒的疫苗更安全，因為它們不會在體內(nèi)復(fù)制。一種編碼EBOV糖蛋白的mRNA疫苗已在小鼠中證明了效力。該疫苗通過CD8＋和CD4＋T細(xì)胞誘導(dǎo)糖蛋白特異性IgG抗體和IFN－γ以及IL－2的強烈表達(dá)，可保護動物免受致命病毒的傷害。

狂犬病毒疫苗

狂犬病是一種人畜共患病，以神經(jīng)癥狀為特征，死亡率近100％。盡管已有疫苗獲批，但每年仍有5萬多人死于狂犬病，這突出表明需要更有效、更廉價的疫苗。

為了滿足這一需求，CureVac利用其RNActive平臺，篩選出編碼狂犬病病毒糖蛋白的未經(jīng)修飾的mRNA疫苗CV7201。在一項臨床前研究中，CV7201可誘導(dǎo)小鼠和豬的高中和抗體滴度，并誘發(fā)抗原特異性CD4＋和CD8＋T細(xì)胞反應(yīng)。但是在I期臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，雖然給藥途徑不影響免疫反應(yīng)，但給藥裝置只有皮內(nèi)注射器產(chǎn)生短暫的體液免疫反應(yīng)。這種弱的給藥效果以及高發(fā)生率的不良事件表明需要進一步優(yōu)化給藥平臺。

隨后，CureVac使用Acuitas Therapeutics生產(chǎn)的專有LNP作為其新疫苗CV7202的載體。在一項臨床前研究中，CV7202誘導(dǎo)產(chǎn)生強抗體滴度和CD8＋和CD4＋T細(xì)胞反應(yīng)。I期臨床試驗結(jié)果表明，兩個1?g劑量可產(chǎn)生高滴度中和抗體以及強適應(yīng)性免疫反應(yīng)，耐受性良好。