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文章背景簡介  

BACKGROUND INTRODUCTION

天冬酰胺連接（N－連接）蛋白糖基化是真核生物中最常見的翻譯后修飾之一，它影響著蛋白質(zhì)的特性，如折疊、穩(wěn)定性、免疫原性和藥代動力學。附著在糖蛋白的N－聚糖可以參與生物過程，如免疫識別反應和干細胞分化。而且，蛋白質(zhì)相關聚糖的改造工程可用于操縱蛋白相關的修復特性，如增強胞內(nèi)的活性和半衰期。

目前，聚糖固有的結構復雜性、生產(chǎn)糖基化蛋白的潛在困難，限制了人們對糖蛋白功能的研究進展。此外，由于聚糖的生物合成既不是模板驅動的，也不是基因編碼的，因此聚糖不能通過重組DNA技術產(chǎn)生。相反，N－聚糖是通過多個糖基轉移酶在多個亞細胞室中的協(xié)調(diào)表達而自然產(chǎn)生的。這種生物合成模式加上缺乏嚴格的校對系統(tǒng)，導致了固有的聚糖異質(zhì)性，并造成了細胞或生物體所表達的聚糖庫中結構的巨大多樣性。而更復雜的問題是，糖基轉移酶的結構與功能之間的關系研究相對缺乏，這就是的聚糖結構預測及其生物合成更加困難。

近年來，細菌糖工程這一研究方向的再次興起，使得生產(chǎn)設計聚糖和糖綴合物作為疫苗和治療方法逐漸成為可能。然而，由于細胞活力的限制和無法在體內(nèi)以精確的比例控制糖基化成分，基于細胞的糖蛋白生產(chǎn)困難重重。

目前，最具特征和最廣泛采用的無細胞蛋白合成系統(tǒng)（CFPS）系統(tǒng)是使用大腸桿菌裂解物來實現(xiàn)體外蛋白質(zhì)合成，但因為大腸桿菌缺乏內(nèi)源性糖基化機制，這些CFPS系統(tǒng)無法制造糖蛋白。

一些真核CFPS系統(tǒng)中可以進行糖基化，包括昆蟲細胞、雜交瘤細胞或哺乳動物細胞等。然而，這僅限于進行糖基化的內(nèi)源性機制。此外，真核生物的CFPS系統(tǒng)在技術上難以制備，通常需要補充微粒體，并且由于新生多肽鏈向微粒體的運輸效率低下，導致蛋白質(zhì)合成和糖基化產(chǎn)量效率低下。

2018年美國西北大學的Thapakorn Jaroentomeechai在《Nature Communications》（中科院一區(qū)，IF＝14．919）發(fā)表題為“Single－pot glycoprotein biosynthesis using a cellfree transcription－translation system enriched with glycosylation machinery”的文章。這項工作研究了一種新的無細胞糖蛋白合成（CFGpS）技術，該技術無縫地將蛋白質(zhì)生物合成與天冬酰胺連接的蛋白糖基化相結合。該技術利用優(yōu)化了的富含糖鏈的大腸桿菌細胞提取物，選擇性地富集糖基化成分，包括寡糖轉移酶（OSTs）和脂聯(lián)寡糖（LLOs）。所得到的提取物可以進行一鍋式的的高效反應并且進行位點特異性的糖基化。

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

基于大腸桿菌的無細胞翻譯系統(tǒng)具有開放性，使得糖蛋白在CFPS的合成具有可能性。該小組最近的一項研究在基于大腸桿菌的CFPS中通過純化的糖基化組分實現(xiàn)了N－糖基化途徑，使大腸桿菌的無細胞系統(tǒng)具有合成糖蛋白的能力。

雖然這些結果建立了基于大腸桿菌提取物生產(chǎn)糖蛋白的可能性，但使用純化的糖基化成分存在幾個缺陷，限制了系統(tǒng)的效用。首先，糖基化成分的制備需要耗時且成本高昂的步驟，即純化多通道跨膜寡糖轉移酶和基于有機溶劑從細菌膜中提取脂聯(lián)寡糖供體。這些步驟大大延長了工藝開發(fā)時間，準備LLO和OST組件各需要3－5天，需要熟練的操作人員和專業(yè)設備，導致產(chǎn)品必須冷藏，只能穩(wěn)定幾個月到一年。糖蛋白生產(chǎn)順序需要遵循先翻譯后糖基化這一策略，這需要20小時的靶蛋白合成，另外12小時的翻譯后蛋白糖基化。在這里，本文通過開發(fā)一種集成的無細胞糖蛋白合成（CFGpS）技術來解決這些缺陷，該技術繞過了OSTs的純化和基于有機溶劑的LLOs提取的需要。這種流水型CFGpS系統(tǒng)的創(chuàng)建是由于兩個重要的發(fā)現(xiàn)：（1）從優(yōu)化的大腸桿菌菌株CLM24中提取的粗提物能夠支持無細胞蛋白表達和N－連糖基化；（2）從CLM24中提取的OST和富含LLO的提取物能夠重復地共激活蛋白質(zhì)合成和N－糖基化，該反應混合物至少需要用編碼目標糖蛋白的DNA啟動。重要的是，CFGpS系統(tǒng)分離了糖蛋白合成成分（即OSTs、LLOs、翻譯機制）和感興趣的糖蛋白靶點的產(chǎn)生，與體內(nèi)系統(tǒng)相比，顯著降低了細胞活力的限制。最終的結果是獲得了一個一鍋式細菌糖蛋白生物合成平臺，通過這個平臺，不同的受體蛋白、OSTs或寡糖結構可以在功能上進行交換，并可為糖基化的形成定制原型。本研究建立的CFGpS將促進糖科學的進一步理解，并在糖蛋白的按需生物制造方面得以應用。

       原文標題 : 無細胞系統(tǒng)+糖基化機制，實現(xiàn)“一鍋式”糖蛋白生物合成