前言?

人類(lèi)自然殺傷(NK)細(xì)胞占所有循環(huán)淋巴細(xì)胞的15%。NK細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞毒性，無(wú)需事先致敏以及細(xì)胞因子和趨化因子的作用。由于NK細(xì)胞能夠識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞，以 NK 細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療領(lǐng)域越來(lái)越受到人們的重視。

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細(xì)胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-T細(xì)胞治療在血液惡性腫瘤取得了巨大的成就。然而CAR-T細(xì)胞仍存在一些不足，例如在實(shí)體瘤的治療中顯示出很低的療效；此外，大多數(shù)的CAR-T細(xì)胞免疫療法需要自體過(guò)繼細(xì)胞移植，因?yàn)槌�非處理HLA屏障，否則異基因T細(xì)胞可能導(dǎo)致移植物抗宿主�。℅VHD）；另外，CAR-T細(xì)胞免疫治療可能會(huì)產(chǎn)生一些副作用，如細(xì)胞因子釋放綜合征。

最新的研究表明，CAR-NK細(xì)胞可能會(huì)克服 CAR-T細(xì)胞的上述缺陷，并顯示出顯著的抗腫瘤作用。CAR-NK細(xì)胞在腫瘤的免疫治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

CAR-NK的研究概況

CAR-NK臨床前研究的數(shù)量逐年增加，這體現(xiàn)在每年都在增加的關(guān)于CAR-NK的研究論文。

此外，在研究的靶標(biāo)方面，Her2是實(shí)體瘤最常用的靶點(diǎn)，而CD19抗原在血液腫瘤中最常見(jiàn)。使用原代NK細(xì)胞的研究中，65%的人在研究B細(xì)胞惡性腫瘤，CD19是最受歡迎的靶點(diǎn)。有趣的是，在使用NK細(xì)胞系的研究中，研究實(shí)體瘤是血液惡性腫瘤的2倍以上。

在臨床研究方面， CD19-CAR-NK細(xì)胞對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤有很高的應(yīng)答率。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK細(xì)胞臨床研究也針對(duì)CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有幾種針對(duì)血液惡性腫瘤的CAR-NK細(xì)胞臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

還有多項(xiàng)針對(duì)實(shí)體瘤的研究處于啟動(dòng)或招募階段。

?CAR結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)

NK細(xì)胞上表達(dá)的功能性CAR分子由三部分組成：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)的信號(hào)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由一個(gè)信號(hào)肽和識(shí)別抗原的單鏈抗體片段（scFv）組成，一段鉸鏈區(qū)將這個(gè)結(jié)構(gòu)連接到跨膜區(qū)，它也在細(xì)胞內(nèi)連接到包含激活信號(hào)的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。成功的CAR設(shè)計(jì)是通過(guò)仔細(xì)的設(shè)計(jì)和功能測(cè)試相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

載體骨架和啟動(dòng)子

載體骨架包含表達(dá)CAR所需的所有元件，如啟動(dòng)子、polyA信號(hào)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段。

啟動(dòng)子的選擇直接影響到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。目前，對(duì)不同啟動(dòng)子在NK細(xì)胞系中的CAR表達(dá)和功能的比較只有一次報(bào)道，而對(duì)原代NK細(xì)胞沒(méi)有比較數(shù)據(jù)。就這一次單個(gè)報(bào)告來(lái)看，還不能確定CAR-NK細(xì)胞的最佳啟動(dòng)子。

目前關(guān)于CAR-NK細(xì)胞的報(bào)道顯示，多種啟動(dòng)子被用于驅(qū)動(dòng)CAR的表達(dá)，無(wú)論是細(xì)胞系來(lái)源的還是原代NK細(xì)胞。在原代CAR-NK和CAR-NK細(xì)胞系中，病毒啟動(dòng)子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成性活性啟動(dòng)子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。

信號(hào)肽

在信號(hào)肽中存在著巨大的異質(zhì)性，這直接轉(zhuǎn)化為不同水平的蛋白質(zhì)分泌效率。對(duì)于CAR-NK和CAR-T細(xì)胞，還沒(méi)有確定最佳信號(hào)肽的比較研究。目前，CD8a-SP是原代NK細(xì)胞最常用的信號(hào)肽序列（16%，71%的研究中未公布）和NK細(xì)胞系的免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號(hào)肽（29%）。

單鏈抗體

單鏈抗體片段是CAR的腫瘤抗原結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域?qū)�決定CAR-NK細(xì)胞的特異性和功能。

由于單鏈抗體不是抗體的天然形式，因此重鏈和輕鏈的順序是人工確定的。到目前為止，對(duì)于CAR-NK設(shè)計(jì)，大多數(shù)更喜歡VH-VL方向，而不是VL-VH方向。Fujiwara等人證明重鏈和輕鏈的順序不影響T細(xì)胞上抗KDR CAR的表達(dá)水平。

此外，細(xì)胞可以配備多個(gè)單鏈抗體，從而擴(kuò)大CAR效應(yīng)細(xì)胞的抗原識(shí)別能力。在這里，有多種選擇：CARs可以用雙元件的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)兩個(gè)CAR結(jié)構(gòu)的表達(dá)；或者將兩個(gè)單鏈抗體融合在一個(gè)結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生串聯(lián)單鏈抗體的“單柄”CAR。雖然這些技術(shù)已用于生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞，但CAR-NK細(xì)胞仍未知。

目前大多數(shù)臨床CAR-T細(xì)胞試驗(yàn)都使用了來(lái)自小鼠抗體的單鏈抗體，這增加了抗小鼠IgG細(xì)胞宿主抗移植物病的風(fēng)險(xiǎn)，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)人源化或篩選全人抗體避免。然而不幸的是，由于這些CAR受體的嵌合特性，即使是人源化的單鏈抗體也可能誘導(dǎo)宿主抗獨(dú)特型免疫反應(yīng)。幸運(yùn)的是，在迄今為止數(shù)量有限的CAR-NK臨床試驗(yàn)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與抗CAR免疫反應(yīng)相關(guān)的重大副作用。

連接區(qū)

重鏈和輕鏈之間的連接區(qū)有助于穩(wěn)定單鏈抗體的構(gòu)象，過(guò)短會(huì)導(dǎo)致多聚體的形成，過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致水解或降低VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)聯(lián)。對(duì)于CAR-NK細(xì)胞，五肽GGGGS的多聚體應(yīng)用最為廣泛，通常為3個(gè)重復(fù)。另一個(gè)旨在增強(qiáng)蛋白水解穩(wěn)定性的連接體是Whitlow“218”連接體：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。

目前，雖然大多數(shù)CAR-NK研究沒(méi)有提供連接細(xì)節(jié)，但已有的研究報(bào)道中，有22項(xiàng)使用了G4S連接，有2項(xiàng)應(yīng)用了218連接。

鉸鏈區(qū)

鉸鏈區(qū)是連接單鏈抗體單位和跨膜結(jié)構(gòu)域的CAR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū)，它通常維持效應(yīng)細(xì)胞中穩(wěn)健的CAR表達(dá)和活性所需的穩(wěn)定性。大多數(shù)CAR-NK構(gòu)建使用CD8α或CD28胞外結(jié)構(gòu)域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區(qū)。

鉸鏈區(qū)的類(lèi)型和長(zhǎng)度對(duì)CAR的功能活動(dòng)有重要影響。但是目前大多數(shù)信息全來(lái)自CAR-T領(lǐng)域，能否直接轉(zhuǎn)化為CAR-NK還有待證明。

在CD28和CD8α鉸鏈區(qū)之間的直接比較中，發(fā)現(xiàn)CD28更有可能促進(jìn)CAR分子的二聚化，因此，CD28鉸鏈區(qū)的CAR產(chǎn)生的激活刺激更強(qiáng)。雖然這可能是有益的，但也可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的副作用。

IgG為基礎(chǔ)的鉸鏈區(qū)也廣泛應(yīng)用于CAR結(jié)構(gòu)�；�于IgG鉸鏈區(qū)的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)的靈活性，該結(jié)構(gòu)通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3結(jié)構(gòu)域組成。鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度可以調(diào)節(jié)以適應(yīng)抗原識(shí)別，但研究發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)越短，細(xì)胞因子的產(chǎn)生越高，CAR-T細(xì)胞增殖越快，體內(nèi)持久性和抗腫瘤效果越好。

對(duì)于CAR-NK細(xì)胞，大多數(shù)研究在原代NK細(xì)胞（16/35）和CAR-NK細(xì)胞系（41/72）中均采用CD8α鉸鏈區(qū)。其它使用的鉸鏈區(qū)包括CD28、IgG Fc結(jié)構(gòu)域和DAP12。

跨膜結(jié)構(gòu)域?

跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域連接CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)激活信號(hào)結(jié)構(gòu)域，CAR-NK最常用的TM部分來(lái)自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。

TM結(jié)構(gòu)域的選擇影響了CAR結(jié)構(gòu)在細(xì)胞功能上的活化程度。通常在NK細(xì)胞上表達(dá)的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM會(huì)導(dǎo)致更多的CD107a脫顆粒和更高的細(xì)胞毒性，因此，TM的具體來(lái)源將決定CAR-NK的活性。

TM結(jié)構(gòu)域的一個(gè)重要方面是，最佳TM區(qū)域應(yīng)遵循T細(xì)胞或NK細(xì)胞上跨膜蛋白的蛋白質(zhì)自然取向（N端到C端順序）。NKG2D雖然是一種強(qiáng)大的NK細(xì)胞激活劑，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜區(qū)。

目前，CD8α和CD28修飾的TM在原代CAR-NK細(xì)胞中最常見(jiàn)，而CD28是CAR-NK細(xì)胞系的首選TM區(qū)域。

CAR-NK激活信號(hào)

CAR的細(xì)胞內(nèi)激活信號(hào)的數(shù)量決定了其屬于哪一“代”CAR。

第一代CAR-NK細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞一樣，只含有CD3ζ信號(hào)。第二代和第三代CAR-NK分別攜帶一個(gè)和兩個(gè)額外的共刺激信號(hào)，共刺激分子通常來(lái)源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相關(guān)受體家族（2B4）。到目前為止，唯一公布的CAR-NK臨床試驗(yàn)采用了第二代CAR-NK構(gòu)建，該構(gòu)建通過(guò)加入IL-15表達(dá)和誘導(dǎo)Caspase9增強(qiáng)活性。

目前大多數(shù)CAR結(jié)構(gòu)依賴(lài)于CD3ζ鏈信號(hào)域，強(qiáng)烈的激活信號(hào)對(duì)于誘導(dǎo)有效的抗腫瘤反應(yīng)很重要，但也可能導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的快速衰竭。因此，共刺激域的組合可用于校準(zhǔn)所需的免疫細(xì)胞反應(yīng)。與基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表現(xiàn)出更快的效應(yīng)器特征，誘導(dǎo)更高水平的IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α。然而，這種強(qiáng)烈的共刺激信號(hào)也會(huì)導(dǎo)致活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD）。

相比較，4-1BB-CD3ζ信號(hào)優(yōu)先誘導(dǎo)記憶相關(guān)基因和持續(xù)的抗腫瘤活性。原因可能是4-1BB結(jié)構(gòu)域改善了CD28結(jié)構(gòu)域引起的T細(xì)胞耗竭。

如上圖所示，在CAR-NK細(xì)胞系和原代CAR-NK細(xì)胞的研究中，CD3ζ幾乎被普遍用作主要的激活域，其中大約一半攜帶一個(gè)額外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代結(jié)構(gòu)，CD28/4-1BB/CD3ζ的組合是最常用的。

CAR的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)載體

隨著基因修飾技術(shù)的進(jìn)步，許多方法被用于產(chǎn)生CAR-NK。兩種主要方法是病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)（使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒），或轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA、轉(zhuǎn)座酶DNA介導(dǎo)的整合以及mRNA電轉(zhuǎn)。

慢病毒

慢病毒能夠高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)周期性和非周期性細(xì)胞，在基因治療領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。迄今為止，已有14篇關(guān)于原代CAR-NK細(xì)胞和44篇關(guān)于CAR-NK細(xì)胞系的研究成功使用慢病毒作為載體。

在臨床前研究中，21項(xiàng)研究使用了第二代病毒，6項(xiàng)研究使用了第三代慢病毒來(lái)產(chǎn)生表達(dá)CAR的NK細(xì)胞系（17個(gè)未知）。在原代CAR-NK細(xì)胞研究中，5項(xiàng)研究使用了第三代慢病毒，7項(xiàng)研究使用了第二代慢病毒載體（2個(gè)未知）。

逆轉(zhuǎn)錄病毒

幾十年來(lái)，逆轉(zhuǎn)錄病毒一直被用作基因治療載體。迄今為止，有20項(xiàng)使用CAR-NK細(xì)胞系的研究和15使用原代NK細(xì)胞的研究應(yīng)用了逆轉(zhuǎn)錄病毒。最近的一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)中，由逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD19 CAR-NK細(xì)胞治療CD19+非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病。在這項(xiàng)研究中，73%的患者有響應(yīng)，8名患者中有7名獲得完全緩解。此外，在所有劑量水平下，CAR-NK輸注后30天內(nèi)反應(yīng)迅速。經(jīng)過(guò)一年的隨訪，仍然可以檢測(cè)到擴(kuò)增的CAR-NK細(xì)胞。輸注后，外周血中的CAR-NK DNA拷貝數(shù)保持穩(wěn)定達(dá)一年之久，這些結(jié)果首次表明逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR-NK細(xì)胞可以在體內(nèi)長(zhǎng)期存活。

不同種類(lèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒被用來(lái)產(chǎn)生CAR-NK細(xì)胞。與γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒相比，RD114α逆轉(zhuǎn)錄病毒在原代NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率上更高。盡管使用不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以在NK細(xì)胞中獲得長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的CAR表達(dá)，但逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的安全性仍然是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題，尤其是與更安全的慢病毒相比。

mRNA電穿孔

電穿孔CAR編碼mRNA是一種快速、有效但是作用短暫的一種方法。迄今為止，有9個(gè)關(guān)于CAR-NK細(xì)胞系和11個(gè)原代CAR-NK細(xì)胞研究使用了mRNA電穿孔。

一般來(lái)說(shuō)，擴(kuò)增或活化的NK細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)高于新鮮分離的NK細(xì)胞。由于mRNA的合成符合GMP的規(guī)定，并且電穿孔可以在潔凈室中進(jìn)行，因此通過(guò)mRNA電穿孔產(chǎn)生符合GMP的CAR-NK是可行的。然而，這種方法的主要缺點(diǎn)是CAR表達(dá)的窗口短暫：電穿孔后，CAR-NK細(xì)胞應(yīng)在7天內(nèi)輸回患者體內(nèi)。

睡美人轉(zhuǎn)座子

基于轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)可以在預(yù)定的位置高效地導(dǎo)入CAR轉(zhuǎn)基因，這是傳統(tǒng)方法所不具備的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)座子主要通過(guò)電穿孔導(dǎo)入NK細(xì)胞，然后通過(guò)轉(zhuǎn)座子酶整合到宿主基因組中。有兩項(xiàng)研究應(yīng)用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生CAR-NK細(xì)胞：一項(xiàng)使用NK-92-MI細(xì)胞，另一項(xiàng)研究將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染到iPSC細(xì)胞，然后分化成NK細(xì)胞。富集后，抗間皮素CARs在iPSC衍生的NK細(xì)胞上穩(wěn)定表達(dá)，并在卵巢癌小鼠模型中發(fā)揮出作用。

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9是一種強(qiáng)大的基因改造技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)依賴(lài)于將Cas9蛋白與引導(dǎo)RNA一起導(dǎo)入NK細(xì)胞。最初，這種技術(shù)被用于原代NK細(xì)胞，以破壞CD38基因，旨在防止NK細(xì)胞與daratumumab （抗CD38）聯(lián)合使用時(shí)的自相殘殺，因?yàn)镃D38在NK細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤和AML細(xì)胞上均有表達(dá)。

最近，CRISPR/Cas9被用于引入新基因。在一些采用HDR模板的研究中，使用K562-mIL-21擴(kuò)增的NK細(xì)胞獲得了超過(guò)75%的敲入效率。然而，在新鮮NK細(xì)胞中，敲入效率僅為3–16%�？偟膩�(lái)說(shuō)，CRISPR/Cas9策略是一種很有前景的技術(shù)，它可以用來(lái)精確地刪除、修復(fù)或?qū)�入特定基因，有望產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤NK細(xì)胞。

小結(jié)

NK細(xì)胞是一類(lèi)獨(dú)特的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，具有不受 MHC 限制的細(xì)胞毒性、產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫記憶等功能。CAR-NK細(xì)胞療法是一個(gè)很有前途的臨床研究領(lǐng)域，對(duì)某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。

目前，對(duì)CAR-NK細(xì)胞的研究越來(lái)越多，基于CAR-T細(xì)胞治療的成功經(jīng)驗(yàn)，以及新技術(shù)和新方法的應(yīng)用，相信CAR-NK細(xì)胞治療一定能夠克服種種挑戰(zhàn)，為腫瘤治療帶來(lái)新的突破。

參考文獻(xiàn)：

1. Chimeric antigen receptornatural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. JHematol Oncol.?2021; 14: 73.

2.?Natural Born Killers: NK Cells in Cancer Therapy. Cancers (Basel). 2020 Jul 31;12(8):2131

       原文標(biāo)題 : CAR-NK中CAR的工程化和設(shè)計(jì)