前言

抗體偶聯(lián)藥物（ADC）在過(guò)去幾年中取得了巨大的發(fā)展勢(shì)頭，十多種ADC藥物被監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于臨床癌癥治療。目前人們著重于開(kāi)發(fā)特定位點(diǎn)的偶聯(lián)方法，通過(guò)引入特異性氨基酸或非天然氨基酸殘基、肽和聚糖，通過(guò)抗體工程實(shí)現(xiàn)選擇性抗體偶聯(lián)。

除了使用合成細(xì)胞毒素外，這些新方法還被應(yīng)用于偶聯(lián)其他有效載荷，如非細(xì)胞毒性化合物、蛋白質(zhì)/肽、聚糖、脂質(zhì)和核酸。非細(xì)胞毒性化合物包括聚乙二醇、抗生素、蛋白質(zhì)降解劑（PROTAC和LYTAC）、免疫調(diào)節(jié)劑、酶抑制劑和蛋白質(zhì)配體。不同的小分子蛋白或多肽已經(jīng)可以通過(guò)非天然氨基酸使用點(diǎn)擊化學(xué)、C-末端工程化甲�；�甘氨酸以及酶或無(wú)酶特異性轉(zhuǎn)肽反應(yīng)偶聯(lián)。這些含有新型有效載荷的位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)藥物（AXC）正處于概念驗(yàn)證和臨床前開(kāi)發(fā)階段，將可能產(chǎn)生新的治療方法，以解決目前未滿足的醫(yī)療需求。

位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)

位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)始于單克隆抗體的工程化或修飾，然后是優(yōu)化的藥物連接子的綴合�？贵w通過(guò)IgG的Fab或Fc區(qū)進(jìn)行工程設(shè)計(jì)，通過(guò)使用基因工程、代謝標(biāo)記或化學(xué)酶修飾引入不同的結(jié)合位點(diǎn)。

 位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)可以通過(guò)基因工程引入特定的位點(diǎn)，例如半胱氨酸（Cys）、谷氨酰胺（Gln）、非天然氨基酸（對(duì)乙酰苯丙氨酸和對(duì)疊氮甲基-L-苯丙氨酸）或短肽標(biāo)簽。通過(guò)Cys的偶聯(lián)相對(duì)簡(jiǎn)單直接，不需要特殊的試劑或酶。THOMABTM是通過(guò)工程化Cys進(jìn)行的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)，是正在開(kāi)發(fā)的首批位點(diǎn)特異性抗體-藥物偶聯(lián)方法之一。在動(dòng)物模型中，使用這種方法產(chǎn)生的ADC不僅表現(xiàn)出高度均質(zhì)性，而且在體內(nèi)表現(xiàn)出更高的療效和治療指數(shù)。

此外，位點(diǎn)特異性偶聯(lián)也可以通過(guò)使用包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、轉(zhuǎn)肽酶/分選酶、糖基轉(zhuǎn)移酶或內(nèi)糖苷酶在內(nèi)的多種酶的化學(xué)修飾方法來(lái)完成。特異性短肽標(biāo)簽內(nèi)氨基酸的酶修飾產(chǎn)生的抗體偶聯(lián)藥物具有高選擇性和穩(wěn)定性，然而其引入的肽標(biāo)簽的潛在免疫原性目前尚不清楚。目前，通過(guò)工程化Cys、非天然氨基酸和酶聚糖重塑的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)已經(jīng)大規(guī)模進(jìn)行，并且產(chǎn)生的多個(gè)抗體偶聯(lián)藥物正在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試。

非細(xì)胞毒性化合物有效載荷

目前，有幾種非細(xì)胞毒性化合物用于位點(diǎn)特異性偶聯(lián)，如聚乙二醇（PEG）、抗生素、免疫調(diào)節(jié)化合物、蛋白質(zhì)降解劑以及在癌癥中過(guò)表達(dá)的受體和蛋白質(zhì)的配體。

PEG

為了延長(zhǎng)抗體片段的半衰期，20多年前首次描述了Fab通過(guò)鉸鏈Cys殘基的PEG化。由于PEG的附著點(diǎn)遠(yuǎn)離表位結(jié)合區(qū)，因此與未修飾的Fab相比，PEG化的Fab的抗原結(jié)合和體外生物活性通常不會(huì)降低。聚乙二醇化也不影響穩(wěn)定性，而抗體片段的半衰期可以顯著增加。聚乙二醇化抗TNF Fab，Certolizumab pegol，已被監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于治療免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病患者，而其他聚乙二醇化Fab也正在進(jìn)行臨床前和臨床開(kāi)發(fā)。

抗生素

一種新型抗體-抗生素偶聯(lián)物（AAC）正在開(kāi)發(fā)，作為一種潛在的治療方法可有效殺死細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌。使用THIOMATM方法，將一種只有在溶酶體中釋放后才被激活的高效抗生素rifalogue與抗金黃色葡萄菌抗體輕鏈上的V205C位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。AAC在體內(nèi)治療菌血癥和消除細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染方面優(yōu)于萬(wàn)古霉素。AAC提供了一種針對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染的獨(dú)特治療方法，目前正在臨床開(kāi)發(fā)中（NCT03162250）。

免疫調(diào)節(jié)化合物

合成的非細(xì)胞毒性酶抑制劑或特異性受體的配體已通過(guò)與抗體位點(diǎn)特異性偶聯(lián)，用于免疫調(diào)節(jié)。如磷酸二酯酶4（PDE4）的酶抑制劑，將高效PDE4抑制劑與抗CD11a抗體偶聯(lián)，免疫偶聯(lián)藥物迅速內(nèi)化入免疫細(xì)胞，并抑制脂多糖誘導(dǎo)的原代人單核細(xì)胞分泌TNF-α。其在小鼠模型中顯示出體內(nèi)抗炎作用。

此外，基于幾種肝X受體（LXR）激動(dòng)劑誘導(dǎo)膽固醇反向轉(zhuǎn)運(yùn)和抗炎的能力，將LXR激動(dòng)劑與抗CD11a抗體偶聯(lián)，單核細(xì)胞CD11a表達(dá)的增加已被發(fā)現(xiàn)與動(dòng)脈粥樣硬化性冠狀動(dòng)脈狹窄相關(guān)。該偶聯(lián)藥物具有對(duì)溶酶體組織蛋白酶B敏感的可裂解接頭，免疫偶聯(lián)物在體外特異性誘導(dǎo)人THP-1單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的LXR激活，而在肝細(xì)胞中沒(méi)有顯著作用。

蛋白降解劑有效載荷

近年來(lái)，位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)被應(yīng)用于蛋白質(zhì)降解領(lǐng)域。蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）依賴于合成的嵌合分子通過(guò)蛋白酶體在細(xì)胞內(nèi)降解蛋白質(zhì)靶標(biāo)。PROTAC在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用在過(guò)去十年中取得了重大進(jìn)展，然而，依然存在一些挑戰(zhàn)，如溶解度和體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。使用PROTAC位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)，可能會(huì)提供一些更優(yōu)的替代方法。

例如，一些PROTAC化合物已被鑒定用于降解含溴結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)-4（BRD4），然而在小鼠靜脈或口服給藥后，表現(xiàn)出不利的理化特性和較差的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。因此，通過(guò)甲硫磺�；鵆ys偶聯(lián)，將這些PROTAC偶聯(lián)到抗C型凝集素樣分子-1（CLL1）的抗體上，該抗體經(jīng)工程化改造具有三個(gè)不成對(duì)的半胱氨酸殘基（LC-K149C、HC-L174C和HC-Y373C），每個(gè)抗體可能連接六個(gè)PROTAC（DAR為~6）。在攜帶HL-60（急性髓細(xì)胞白血�。┘�(xì)胞異種移植物的小鼠中，單次靜脈注射抗體-PROTAC偶聯(lián)藥物可產(chǎn)生劑量依賴性的腫瘤生長(zhǎng)抑制。此外除了PROTAC，位點(diǎn)特異性偶聯(lián)也被應(yīng)用于溶酶體靶向嵌合體（LYTAC）。

蛋白質(zhì)和多肽的有效載荷

目前，蛋白質(zhì)或多肽也已被用于位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)。例如，一種新的抗體-唾液酸酶偶聯(lián)藥物，在抗HER2抗體重鏈的C末端附近引入短肽標(biāo)簽LCTPSR通過(guò)酶反應(yīng)生成疊氮化物，然后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)將含疊氮化物的抗體偶聯(lián)到唾液酸酶上。抗體唾液酸酶偶聯(lián)藥物對(duì)HER2陽(yáng)性癌癥細(xì)胞的ADCC活性增強(qiáng)。活性增加與癌癥細(xì)胞脫乙�；�、自然殺傷細(xì)胞（NK）與抑制性Siglec受體的結(jié)合減少以及與NKG2D的結(jié)合增強(qiáng)有關(guān)。

此外，也有研究探索抗體與癌癥中過(guò)表達(dá)蛋白質(zhì)的配體位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。例如，將抗CD3 Fab或scFv偶聯(lián)到這些配體上以產(chǎn)生雙特異性T細(xì)胞接合器。在一項(xiàng)研究中，一種非天然氨基酸pAcF被摻入抗CD3 Fab的兩個(gè)不同位置（LC-S202和HC-K138），將工程化Fab與前列腺特異性膜抗原（PSMA）的合成高親和力配體偶聯(lián)。該雙特異性T細(xì)胞接合器在體外對(duì)前列腺癌癥細(xì)胞株表現(xiàn)出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性，在體內(nèi)也表現(xiàn)出良好的抗癌效果。

AMG133是抗GIPR抗體與GLP-1多肽的偶聯(lián)藥物，AMG133分子中抗體偶聯(lián)的GLP-1多肽分子經(jīng)過(guò)改造，在多肽的第8位和第22位引入非天然氨基酸Aib，增加了多肽部分的血漿穩(wěn)定性和半衰期�？贵w分子的重鏈引入了E384C位點(diǎn)突變，通過(guò)cys的巰基將多肽偶聯(lián)至抗體重鏈Fc區(qū)域。其在肥胖患者的1期臨床試驗(yàn)中顯示出卓越的減重藥效。

核酸有效載荷

siRNA是一種21-25核苷酸的雙鏈復(fù)合物，在誘導(dǎo)特定mRNA的降解和抑制其翻譯方面具有高度選擇性。為了增強(qiáng)特異性組織或細(xì)胞遞送，已經(jīng)做出了許多努力來(lái)開(kāi)發(fā)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)方法，以產(chǎn)生抗體-siRNA偶聯(lián)藥物（ARC）。

Song等人首先研究了使用非共價(jià)復(fù)合物遞送siRNA的方法。使用重組方法將來(lái)自抗gp160（HIV包膜）Fab片段的重鏈的C末端與魚(yú)精蛋白融合，魚(yú)精蛋白含有許多與DNA相互作用的帶正電荷的氨基酸殘基。然后將來(lái)自Fab-魚(yú)精蛋白融合物與siRNA雜交，siRNA可以被遞送并沉默HIV-1包膜細(xì)胞中的基因表達(dá)，并抑制HIV在T細(xì)胞中的復(fù)制。與魚(yú)精蛋白融合的HER2單鏈抗體也能將siRNA特異性地傳遞到HER2陽(yáng)性的乳腺癌癥細(xì)胞中。

此外，siRNA也可以與抗體中特定位點(diǎn)進(jìn)行直接偶聯(lián)。Cuellar等人首次報(bào)道了使用THIOMBTM方法將抗體與siRNA直接偶聯(lián)。他們選擇了七個(gè)針對(duì)不同內(nèi)化程度靶點(diǎn)的抗體，這些抗體在重鏈（A118C）或輕鏈（V205C）中引入了不成對(duì)的Cys，然后和其他幾個(gè)基因特異性的siRNA偶聯(lián)。在體外測(cè)試的ARC中，在表達(dá)高抗原水平的細(xì)胞中，兩種表現(xiàn)出中度基因沉默（≤50%沉默），一種（抗TENB2-siRNA偶聯(lián)藥物）表現(xiàn)出最高沉默（>50%）。

目前，抗體-寡核苷酸偶聯(lián)藥物已開(kāi)始進(jìn)入臨床。幾家生物技術(shù)公司針對(duì)許多不同的適應(yīng)癥進(jìn)行試驗(yàn)，包括罕見(jiàn)病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥。這些位點(diǎn)特異性抗體-寡核苷酸偶聯(lián)藥物為未來(lái)許多未滿足的醫(yī)療需求創(chuàng)造了巨大的機(jī)會(huì)。

小結(jié)

作為下一代方法，位點(diǎn)特異性抗體偶聯(lián)為生產(chǎn)具有改善治療指數(shù)的同質(zhì)ADC提供了巨大的潛力。隨著抗體工程方法的不斷進(jìn)步，許多新方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)。它們已被應(yīng)用于偶聯(lián)許多不同的有效載荷，包括非細(xì)胞毒性化合物、小蛋白/肽和siRNA，而不僅僅是ADC的合成細(xì)胞毒素。這些獨(dú)特的抗體偶聯(lián)物擁有巨大的潛力開(kāi)發(fā)針對(duì)不同疾病的新療法，造�；颊�。

參考文獻(xiàn)：

1.Site-Specific Antibody Conjugation with Payloads beyond Cytotoxins. Molecules. 2023 Jan 17;28(3):917

       原文標(biāo)題 : 位點(diǎn)特異性AXC新型有效載荷