前言

嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法是一種過繼細胞療法，自體T細胞通過基因工程表達CAR以特異性殺死腫瘤細胞。自體CD19靶向CAR-T細胞目前已獲得大多數(shù)主要監(jiān)管機構的批準，包括美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、歐洲藥品管理局（EMA）和中國NMPA。這些CAR-T細胞改變了臨床實踐，顯示出強大的抗腫瘤活性，

然而，在實體瘤患者中開發(fā)具有臨床實用性的CAR-T細胞仍然面臨重重困難，原因在很大程度上是未知的。有許多可能的原因，包括：（1）特異性不足的靶抗原；（2） 遞送不力；（3） 短持續(xù)性；（4） 效應器功能喪失；和（5）腫瘤抗原異質性。

因此，有必要從過往的CAR-T臨床前和臨床研究中汲取經(jīng)驗教訓，分析CAR-T細胞技術的要素和挑戰(zhàn)，并將基礎、臨床和實踐等方面的因素考慮在內，采取應對策略，從而使CAR-T技術能夠成為可負擔的治療模式。

了解CAR-T細胞在實體瘤中失敗的原因

遞送不力

CAR T細胞研究和開發(fā)中需要回答的兩個基本問題是，T細胞在靜脈注射后會去哪里，以及是它們進入腫瘤的有效性。

模型的臨床前數(shù)據(jù)表明，很少有注射的CAR-T細胞最初進入腫瘤，注射到同基因小鼠體內的小鼠T細胞只持續(xù)幾周。人體的臨床試驗數(shù)據(jù)表明，CAR-T細胞最初在肺部和次級淋巴器官中積累，然后在接下來的24-48小時內非常低效地轉移到腫瘤中。

CAR-T細胞進入腫瘤首先需要識別內皮細胞表面分泌并結合的趨化因子，內皮細胞主要位于腫瘤間質中，而不是腫瘤細胞富集區(qū)。這種最初的內皮識別之后是由選擇素介導的滾動粘附，然后是整合素的牢固粘附。在趨化因子（特別是CXCL9、CXCL10、CXCL11以及CCL5）的驅動下，T細胞然后遷移到腫瘤基質中。在這里，血管周圍細胞、細胞外基質蛋白和間充質基質細胞（主要是成纖維細胞）組成了屏障。一些T細胞通過間質遷移，更少的T細胞最終在腫瘤衍生趨化因子的引導下進入腫瘤細胞富集區(qū)，在那里它們可以殺死腫瘤細胞，這一過程需要與腫瘤細胞上的ICAM1結合。這一過程效率極低，導致很少的T細胞成功地與腫瘤細胞相互作用。這里存在許多缺乏效率的原因，包括趨化因子-CCR失配、粘附受體缺陷和充當屏障的細胞外基質。

另一個重要但被低估的問題可能是CAR-T細胞向淋巴組織和遠離實體瘤的“誤導”。到目前為止，CAR T細胞的制造主要受到在B細胞白血病或淋巴瘤患者中測試CD19靶向產(chǎn)品的試驗產(chǎn)生的數(shù)據(jù)指導，這些試驗強調了淋巴結和/或骨髓運輸、抗腫瘤活性的擴展和持久性的重要性。已知具有高水平CCR7和CD62L表達的T細胞優(yōu)先運輸?shù)搅馨徒Y或骨髓。因此，大多數(shù)當前方案的目標是產(chǎn)生主要具有中樞記憶細胞（CD62L高和CCR7高CD45RO+）表型的CAR-T細胞，而不是效應記憶細胞（CD 62L低和CCR7-低CD45RO++）表型，這通常不利于向腫瘤的轉移。

此外，應考慮另外兩個注意事項。首先，冷凍保存可能會影響CD62L的表達，從而影響運輸。其次，CD62L被認為通過其他機制促進抗腫瘤活性，具體而言，CD62L可能引導T細胞向某些實體瘤中存在的三級淋巴結構內的高內皮細胞微靜脈運輸。這些淋巴結構可能促進T細胞浸潤，并改善抗腫瘤免疫反應。

短持久性

在涉及實體瘤患者的臨床試驗中，就CAR-T細胞的持久性而言，使用PCR或流式細胞術檢測，迄今為止進行的幾乎每一項試驗都顯示CAR-T細胞僅存在于血液樣本中。血液中CAR T細胞DNA轉錄物的范圍為每微克DNA103至104個拷貝，輸注后僅在約一個月內檢測到CAR-T細胞，峰值通常出現(xiàn)在10-14天。相比之下，在白血病患者中測試CD19靶向CAR-T細胞的大多數(shù)成功試驗都發(fā)現(xiàn)，血液中有大量的CAR-T細胞，通常為每微克DNA 105-106個拷貝，其持續(xù)時間從幾個月到幾年不等。

總之，臨床前和臨床研究的結果表明，靜脈注射后，CAR-T細胞向腫瘤的轉運效率非常低，而且大多數(shù)這種轉運可能在注射后不久發(fā)生。從人類研究中獲得的有限數(shù)據(jù)表明，進入實體瘤的少數(shù)CAR-T細胞具有有限的持久性，并且不會廣泛增殖。

效應器功能喪失

CAR-T細胞的臨床前研究一致發(fā)現(xiàn)，它們的細胞毒性活性最初很高，但隨著時間的推移逐漸降低�；�因組和表觀基因組的變化都與這種低功能狀態(tài)有關。誘發(fā)這種進行性功能減退狀態(tài)的原因尚不完全清楚�？赡芘cTME中存在的多種因素相關，包括低pH、缺氧、由于關鍵氨基酸和葡萄糖水平低而導致的營養(yǎng)缺乏、高水平的活性氧（ROS）、免疫抑制介質（如TGF-β、PGE2、腺苷和IL-10）的存在，以及與骨髓來源的抑制細胞和CD4+調節(jié)性T細胞的相互作用。T細胞內在因素包括由免疫檢查點（如PD-1、CTLA4、TIM3、TIGIT和LAG3）和抑制性細胞內信號通路（如DGK、NR4A、SHP1和cbl-b）介導的“調節(jié)性關閉”。此外，還有多種表觀遺傳學變化。

腫瘤異質性與抗原擴散

與B細胞惡性腫瘤或多發(fā)性骨髓瘤不同，實體瘤中的抗原表達幾乎總是較低且更異質。因此，除非CAR-T細胞誘導某種旁觀者或抗原擴散效應，或靶向多種抗原，否則成功治療的可能性很低。

我們可以汲取的經(jīng)驗教訓

某些實體瘤患者現(xiàn)在可以使用過繼性T細胞轉移成功治療，其中最顯著的成功是黑色素瘤患者的TIL治療。在非小細胞肺癌患者中使用TIL也取得了有希望的結果。我們可以從這些成功中學到什么，以使CAR-T細胞在實體瘤中取得更大的成功？

針對淋巴結轉移優(yōu)化的T細胞可能不是針對實體瘤的最佳細胞

與優(yōu)先運輸至外周位點的效應細胞或效應記憶細胞相比，CD62L和CCR7在幼稚或中央記憶T細胞上的高表達能夠優(yōu)先運輸至次級淋巴結和骨髓。當用于開發(fā)靶向實體瘤的CAR-T細胞時，這些表型的細胞可能是次優(yōu)的。實體瘤導向的CAR-T細胞被設計為靶向在實體瘤細胞表面表達的完整抗原。因此，當這些細胞進入骨髓或淋巴結時，它們將不會遇到它們的抗原，因此不會被激活以增殖或分化為效應細胞，除非腫瘤已經(jīng)轉移到這些位置。數(shù)據(jù)顯示，在實體瘤模型中，效應器CAR-T細胞比記憶T細胞更有效。因此，使用旨在優(yōu)化淋巴結運輸?shù)臉藴史桨府a(chǎn)生CAR-T細胞可能是實體瘤需要避免的一個關鍵教訓。

DC交互可能很重要

TIL或TCR-T細胞和CAR T細胞之間的一個重要區(qū)別是前者可以被DC廣泛激活，DC可以提供最佳的共刺激信號。這種共刺激可以發(fā)生在淋巴結和骨髓中。找到利用DC激活能力的方法，以增強CAR-T細胞增殖和持續(xù)的能力，是我們應該嘗試從涉及TIL的試驗中吸取的經(jīng)驗。

可能不需要長期持久性

普遍認為，CAR-T細胞的成功與CAR-T細胞的持久性密切相關。然而，由于多種原因，在實體瘤患者中測試CAR-T細胞的臨床試驗中，持久性的重要性尚未得到證實。此外，來自實體瘤模型的數(shù)據(jù)表明，CAR-T細胞的持久性與T細胞功能低下水平的增加有關。

解決這一難題的方法如修飾CAR-T細胞，使其更持久，更不易發(fā)生功能低下。過去幾年，使用這種方法在實體瘤患者中取得了一些令人鼓舞的成功。然而，另一種需要考慮的方法是不考慮持久性，而是使用多次給藥策略給予新鮮的CAR-T細胞。隨著時間的推移，注射的CAR-T細胞會耗盡，它們可以被新劑量的高活性CAR-T細胞取代。這種方法減少CAR成分的免疫原性是必要的，以避免多次給藥的細胞被排斥。

靶向多種腫瘤抗原很重要

除了激活機制的差異外，TIL和CAR-T細胞之間的一個重要差異是，前者本質上是多克隆的，因此可能靶向不止一種抗原。任何成功治療實體瘤患者的CAR-T細胞療法都需要靶向多個腫瘤特異性靶點，最佳地觸發(fā)某種旁觀者效應或誘導抗原擴散到內源性免疫系統(tǒng)。例如，通過設計分泌FLT3配體的CAR-T細胞對DC的募集，以及使用4-1BB激動劑的DC激活，以促進內源性T細胞反應和抗腫瘤活性增強。

如何更好地開發(fā)CAR-T

為了應對這些挑戰(zhàn)，可以考慮通過優(yōu)化兩種不同的策略來向前邁進，以在實體瘤患者中取得更大的成功。策略1是該領域的當前方向，基于為血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者開發(fā)的傳統(tǒng)“記憶細胞”模式。策略2采用不同的“短命效應細胞”模式。

策略1：記憶細胞模式

這種方法的目標是最大限度地提高CAR-T細胞的運輸和持久性，同時最大限度地降低CAR T功能低下的程度。作為策略的一部分，大劑量化療的淋巴結清除用于增強植入。CAR-T細胞的持久性和低功能已經(jīng)通過向T細胞引入特定的遺傳改變（如通過CRISPR）來抑制可能的抑制因子來解決，允許T細胞“休息”，從而防止慢性刺激，或直接通過使用能夠分泌細胞因子或其他蛋白質的武裝CAR-T細胞來改變TME。

與該策略相關的一個主要挑戰(zhàn)是需要引入多種基因改變。在過去的幾年里，許多研究已經(jīng)能夠使用標準的CRISPR技術敲除一個或多個基因，并且開發(fā)了許多更先進的CRISPR技術，能夠以非常低的脫靶突變率進行高效的基因編輯。

衍生自誘導多能干細胞（iPSC）的異基因T細胞的開發(fā)也可以提供一種替代方法，通過允許進行多種遺傳改變來改善CAR-T細胞的運輸和持久性。iPSC將首先使用各種CRISPR引導物進行修飾，從而能夠敲低選定的基因，使細胞具有低免疫原性，然后使用能夠敲低T細胞功能的選定關鍵抑制劑的引導物。在選擇具有所有預期改變的克隆后，可以添加額外的基因來增強運輸或功能。

策略2：短命效應細胞模式

盡管沒有得到很好的研究，但一些數(shù)據(jù)支持在實體瘤小鼠模型中使用壽命更短、更像效應器T細胞的優(yōu)越性。例如在對間皮素靶向CAR-T細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，具有CD28–CD3ζ胞內結構域（更像效應器）的細胞比具有4-1BB–CD3z胞內結構域的細胞具有更好的抗腫瘤活性。

鑒于持久性不是目標，策略2也可能使用mRNA轉導的CAR T細胞。這種方法的一個明顯優(yōu)點是對轉基因的大小沒有限制，可以通過電穿孔引入一種以上的mRNA并同時表達，從而能夠引入多種遺傳變異。

然而，使用這種方法制備的mRNA–CAR-T細胞的一個潛在限制是，與策略1中的“一次性”方法相比，必須隨時間給藥多劑量CAR-T細胞的成本問題。盡管患者需要再次輸注，但這與化療或免疫檢查點抑制劑的給藥類似，通常每4-6周給藥一次，有時會持續(xù)多年。

小結

解決CAR-T細胞療法在實體瘤患者中的應用所面臨的眾多挑戰(zhàn)是一項艱巨的任務。目前的治療方法對實體瘤患者基本無效，其中的原因我們并沒有完全理解。獲得更多更好的關于CAR-T細胞在接受治療的患者中的運輸、持久性和功能的信息對于解決這些方面的問題至關重要。

治療成功的大量障礙可能需要多種免疫逃避機制的共同靶向。這些策略將包括使用CAR工程的優(yōu)化，在離體T細胞擴增過程中優(yōu)化條件以促進特定T細胞亞型的出現(xiàn)，以及操縱宿主以改變TME或刺激天然T細胞，可能需要使用所有這些方法來實現(xiàn)最佳結果。

參考文獻：

1.CART cell therapy for patients with solid tumours: key lessons to learn andunlearn. Nat Rev Clin Oncol.2023 Oct 30

       原文標題 : 實體瘤的CAR-T細胞治療：關鍵的經(jīng)驗教訓