01

文章背景簡介   

BACKGROUND INTRODUCTION

作為典型的甲基營養(yǎng)酵母之一，畢赤酵母（也稱為Komagataella phaffii）不僅被廣泛用作異源蛋白表達(dá)的優(yōu)良宿主，而且在有效生物合成經(jīng)濟(jì)化合物如nootkatone（諾卡酮）、類胡蘿卜素、葉黃素、蓖麻油酸、透明質(zhì)酸和達(dá)美烯二醇II等方面表現(xiàn)出良好的潛力。

使用甲醇作為碳源是巴斯德畢赤酵母最有利的特性之一。來自甲醇利用（MUT）途徑的幾個啟動子被鑒定為甲醇依賴性強(qiáng)啟動子，如PAOX1（醇氧化酶1的啟動子）、PFLD1（甲醛脫氫酶1的啟動基）和PDAS（二羥基丙酮合酶的啟動子）。相反，PPEX8（過氧化物酶體基質(zhì)蛋白的啟動子）或PAOX2（醇氧化酶2的激活子）被歸類為弱啟動子�？紤]到這些啟動子受到甲醇的嚴(yán)格調(diào)控，當(dāng)使用甲醇作為碳源和誘導(dǎo)劑時，它們可用于有效生產(chǎn)外源蛋白。

由于畢赤酵母能夠進(jìn)行快速和高密度發(fā)酵，它不僅被用作異源蛋白表達(dá)的優(yōu)良宿主，而且在小分子化合物的有效生物合成方面表現(xiàn)出良好的潛力。然而，巴斯德畢赤酵母的基礎(chǔ)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于釀酒酵母，導(dǎo)致缺乏可用的生物元素。特別是，在畢赤酵母中，可用于外源蛋白表達(dá)或生物合成途徑構(gòu)建的強(qiáng)內(nèi)源性啟動子元件較少。

為了從畢赤酵母鑒定更多可用的內(nèi)源性啟動子，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥物生物技術(shù)研究所Weiwang Dou等人開展了相關(guān)研究，并于2021年8月在《Microbial cell factories》（IF=6.4，Q1）發(fā)表了題為“Screening and evaluation of the strong endogenous promoters in Pichia pastoris”的文章。

02

所用到的主要方法

METHODS   

1、酵母在不同碳源培養(yǎng)基中生長曲線的測定

2、RNA-seq分析

3、實(shí)時定量PCR（RT-qPCR）分析

4、PXXX-lacZ載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

5、β?半乳糖苷酶活性測定

6、β-胡蘿卜素生物合成途徑啟動子庫的構(gòu)建

7、β-胡蘿卜素產(chǎn)量的測量

03

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT 

盡管大多數(shù)研究都集中在強(qiáng)啟動子上，但值得注意的是，強(qiáng)啟動子不適合用于某些應(yīng)用。例如，具有中等表達(dá)水平的啟動子有時更適合用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或伴侶表達(dá)。因此，還應(yīng)重視對具有不同轉(zhuǎn)錄活性的各種啟動子的研究。該研究基于RNA-seq數(shù)據(jù)和LacZ報告子系統(tǒng)，篩選出8個在三種常用培養(yǎng)基中表現(xiàn)出較強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的新型內(nèi)源性啟動子，選擇了一種異質(zhì)性β-胡蘿卜素生物合成途徑來進(jìn)一步評估這些啟動子的可用性。研究還發(fā)現(xiàn)，同時多次使用同一啟動子可以產(chǎn)生顯著的競爭效應(yīng)，這可能會顯著降低靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

該研究基于RNA-seq和LacZ報告子系統(tǒng)，在三種常用培養(yǎng)基中篩選出8個有助于提高轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和β-半乳糖苷酶活性的強(qiáng)內(nèi)源性啟動子。其中，P0019、P0107、P0230、P0392或P0785所貢獻(xiàn)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平在生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期基本不變。P0208或P0627的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出生長依賴性特征（對數(shù)期表達(dá)水平較低，穩(wěn)定期表達(dá)水平較高）。在生長60小時后，P0208、P0627、P0019、P0407、P0392、P0230、P0785或P0107貢獻(xiàn)的β-半乳糖苷酶活性相對低于PGAP，但高于PACT1。本研究為了評估這些啟動子的可用性，將其中幾個啟動子隨機(jī)應(yīng)用于巴斯德畢赤酵母的異質(zhì)性β-胡蘿卜素生物合成途徑，這些突變體的β-胡蘿卜素最高產(chǎn)量可達(dá)1.07 mg/g。此外，同時多次使用同一啟動子可以產(chǎn)生顯著的競爭效應(yīng)，這可能會顯著降低靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

該研究中鑒定的新型強(qiáng)內(nèi)源性啟動子增加了畢赤酵母中可用的啟動子元件的數(shù)量。研究觀察到的競爭效應(yīng)表明，當(dāng)在一個酵母菌株中同時使用相同的啟動子進(jìn)行繁殖時，需要仔細(xì)的預(yù)評估。這項(xiàng)工作也為巴斯德畢赤酵母的工程應(yīng)用提供了一種有效的策略來識別更多新的生物元素。

簡而言之，本研究的主要內(nèi)容有:

1、基于RNA-seq篩選不依賴于碳源的潛在強(qiáng)啟動子

2、候選啟動子轉(zhuǎn)錄活性的比較

3、P0208和P0627是新的生長依賴性啟動子

4、通過異質(zhì)性β-胡蘿卜素生物合成途徑評估候選啟動子

5、在酵母菌株中多次使用一個啟動子時存在顯著的競爭效應(yīng)

       原文標(biāo)題 : 畢赤酵母強(qiáng)內(nèi)源啟動子的篩選與評價