一種畢赤酵母基因工程表達(dá)的光遺傳調(diào)控系統(tǒng)
01
文章背景簡(jiǎn)介
BACKGROUND INTRODUCTION
上個(gè)世紀(jì),外源化學(xué)誘導(dǎo)劑和可溶性轉(zhuǎn)錄因子(TFs)在基因調(diào)控中的應(yīng)用是促進(jìn)生物技術(shù)和合成生物學(xué)快速發(fā)展的主要?jiǎng)恿χ。然而,由于其可逆性有限、誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)運(yùn)基于擴(kuò)散,存在著潛在的脫靶效應(yīng)、轉(zhuǎn)運(yùn)延遲和毒性等多種缺陷。
光遺傳調(diào)控具有無(wú)創(chuàng)性、可逆性和高時(shí)空分辨率等優(yōu)點(diǎn),有效突破了生化調(diào)控的限制。研究者將光遺傳工具應(yīng)用于真核細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控。 Yang等人開發(fā)了Lighton和Lightoff系統(tǒng),報(bào)道了一個(gè)適用于釀酒酵母的只包含一個(gè)單體光敏蛋白LVAD的Ylighton系統(tǒng)。它是Lexa-VVD(LevI)和Gal4蛋白(Gal4AD)激活結(jié)構(gòu)域的融合, 以EL222為基礎(chǔ)構(gòu)建了釀酒酵母光調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)能產(chǎn)生8.49±0.31g/L異丁醇和2.38±0.06g/L 2-甲基-1丁醇。 Wu等人以EL222為基礎(chǔ),構(gòu)建了斑馬魚光遺傳表達(dá)系統(tǒng)TaEL。Litoralis紅桿菌的光敏蛋白EL222是基于光誘導(dǎo)同二聚反應(yīng)的系統(tǒng)之一,由222個(gè)氨基酸(AA)組成。 EL222的N端為光氧電壓(LOV)結(jié)構(gòu)域,C端為螺旋轉(zhuǎn)螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)域。 當(dāng)EL222受到藍(lán)光照射時(shí),黃素單核苷酸(FMN)與LOV的結(jié)合使Jα螺旋偏離LOV,從而釋放HTH,使EL222同二聚并與被稱為克隆1-20 bp(C120)的調(diào)控元件結(jié)合。在黑暗中,F(xiàn)MN與LOV解離。 LOV回到基態(tài),抑制HTH與DNA的結(jié)合, EL222自發(fā)逆轉(zhuǎn),導(dǎo)致EL222同聚物迅速解聚和失活。
作為真核生物,畢赤酵母(Pichia pastoris)具有真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn),如蛋白質(zhì)加工、折疊和翻譯后修飾等。與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比,畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有更快、更簡(jiǎn)單、更便宜、表達(dá)水平更高的特點(diǎn)。然而,最常用的誘導(dǎo)劑甲醇具有劇毒和易燃的特性,在生產(chǎn)過程中我們很難對(duì)甲醇進(jìn)行監(jiān)測(cè)。因此,迫切需要探索一種新的調(diào)控方法。光遺傳調(diào)控可以有效地避免傳統(tǒng)化學(xué)誘導(dǎo)劑的缺點(diǎn),是調(diào)控P.pastoris表達(dá)的良好方法。
華中科技大學(xué)Zhiqian Wang等人,開發(fā)了一個(gè)名為pBctrl的光開關(guān)基因表達(dá)系統(tǒng)用于P. pastoris基因工程表達(dá)。該系統(tǒng)包括一組專門設(shè)計(jì)用于匹配P. pastoris中的EL222的光調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。在定制啟動(dòng)子的幫助下,藍(lán)光激活轉(zhuǎn)錄因子VP16-EL222在P. pastoris中起作用。最高感應(yīng)比達(dá)到79.7倍。此外,pBctrl系統(tǒng)被證明對(duì)基因表達(dá)具有可逆、快速、定量和時(shí)空控制。當(dāng)使用重組脂肪酶作為報(bào)告基因時(shí),可以觀察到酶的活性和過表達(dá)。這種設(shè)計(jì)易于在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施,并提供了一種新穎、快速、無(wú)污染的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)方法。2022年11月,他們?cè)贏CS Synthetic Biology期刊(生物2區(qū) IF 5.25)發(fā)表了“Design and Characterization of an Optogenetic System in Pichia pastoris”,文章詳細(xì)描述了該系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和表征,并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該研究為畢赤酵母中基因調(diào)控提供了一種新思路,具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
02
所用到的主要方法
METHODS
1、PBCTRL的構(gòu)建
2、倒置熒光顯微鏡觀察
3、共焦熒光成像
4、照明和光學(xué)測(cè)量
5、酶標(biāo)儀測(cè)量
6、流式細(xì)胞術(shù)
7、瓊脂平板顯像
8、脂肪酶活性定量測(cè)定
03
文章主要內(nèi)容摘要
ABSTRACT
畢赤酵母(Pichia pastoris)是商品化生產(chǎn)許多有價(jià)值蛋白質(zhì)的主要宿主系統(tǒng)。傳統(tǒng)上,畢赤酵母中的基因表達(dá)調(diào)控是通過甲醇誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的,但這種方法存在毒性和易燃性等問題。光遺傳技術(shù)提供了一種替代和更清潔的基因調(diào)控方法。本研究利用光敏蛋白EL222設(shè)計(jì)了一種新型“單組分”光遺傳系統(tǒng),在藍(lán)光下誘導(dǎo)表達(dá),最高誘導(dǎo)比為79.7倍。該系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、高效、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),并且可以通過合理設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)和擴(kuò)展其應(yīng)用。本研究為畢赤酵母中基因調(diào)控提供了一種新思路,具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
簡(jiǎn)而言之,本文的主要研究?jī)?nèi)容有:
1. 基于 el222的 gs115表達(dá)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)
2. 藍(lán)光誘導(dǎo)單個(gè)細(xì)胞集落的激活
3. 劑量依賴性激活
4. 在單細(xì)胞水平上評(píng)估性能
5. 光開關(guān)空間激活
6. pBctrl 系統(tǒng)的時(shí)間行為
7. 重組脂肪酶的表達(dá)
原文標(biāo)題 : 一種畢赤酵母基因工程表達(dá)的光遺傳調(diào)控系統(tǒng)
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