前言

CpG 寡聚脫氧核苷酸（CpG-ODN）是一種免疫調(diào)節(jié)合成寡核苷酸，通過特異性地刺激Toll樣受體9（TLR-9），誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。機(jī)體在感染后，病原體表達(dá)的進(jìn)化上保守的分子結(jié)構(gòu)可以觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，這些結(jié)構(gòu)被稱為病原體相關(guān)分子模式，被宿主TLRs識別。病原體相關(guān)的分子模式，如脂多糖和脂蛋白被TLR4和TLR2識別；細(xì)菌的鞭毛蛋白被TLR5識別；dsRNA被TLR3識別，而ssRNA被TLR7/8識別；存在于細(xì)菌和病毒DNA中的未甲基化CpG基序被TLR9識別。

TLR激活引發(fā)的先天免疫反應(yīng)的特征是產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子、趨化因子、I型IFN和抗菌肽。隨后，宿主產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高親和力抗體，并產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞，提供殺菌免疫并保持免疫記憶，以防止隨后的感染。由于CpG能夠有效地誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)，并有助于適應(yīng)性免疫，因此它們作為疫苗佐劑的潛在應(yīng)用備受關(guān)注。

CpG的種類

根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，CpG-ODNs 可分為 A，B 和 C 3種類型。其中，B 型 CpG是發(fā)現(xiàn)最早、研究得最清楚的類型。它由一個或多個CpG基序組成，通常位于硫代磷酸酯骨架上。與天然磷酸二酯酶核苷酸相比，這種主鏈增強(qiáng)了對核酸酶消化的抵抗力，為其提供了更長的體內(nèi)半衰期（30–60分鐘，而磷酸二酯酶為5–10分鐘）。B型CpG觸發(fā)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）分化并產(chǎn)生TNF-α，并刺激B細(xì)胞增殖和分泌IgM。

A 型 CpG以含有CpG 二核苷酸的回文序列為核心，兩端為 poly G尾，磷酸二酯鍵骨架為部分硫代修飾。這類 CpG通過回文序列和 poly G 形成高級結(jié)構(gòu)，能夠活化 pDC 誘生大量 I 型干擾素，但對B 細(xì)胞活性很弱。B型CpG與A型CpG的不同活性很大程度上是由于CpG/TLR9復(fù)合物在pDC內(nèi)體中的保留時間不同。B型CpG通過早期內(nèi)體快速轉(zhuǎn)運(yùn)到晚期內(nèi)體，而A型CpG在早期內(nèi)體中保留的時間更長。A型CpG這種結(jié)構(gòu)特征可導(dǎo)致CpG 分子在溶液中形成復(fù)雜多聚體，因此其在臨床上的研究一直進(jìn)展緩慢，最近研究集中在將其包裝成穩(wěn)定的病毒樣顆粒（VLP），用作佐劑使用。

C型CpG在完全由硫代磷酸核苷酸組成方面類似于B型，但在包含回文CpG基序方面類似于A型，因此可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或二聚體。它兼具 A 和 B 型 CpG的活性，既能活化pDC，又能活化 B 細(xì)胞。

不同 CpG 基序作用于不同物種引起的免疫刺激效應(yīng)有所差異，具有種屬特異性，同時 CpG 的核心序列、回文結(jié)構(gòu)等均對其活性有顯著影響。

CpG的基序

1995 年發(fā)表的論文中首次提出了CpG 基序的概念。CpG 基序是指以非甲基化 CpG 為核心、5' 端為 2個嘌呤、3' 端為 2 個嘧啶的六核苷酸序列，如GACGTT 和 AACGTT 等。CpG 基序中CpG 二核苷酸為活性所必需，旁側(cè)序列也與活性密切相關(guān)，不但決定活性的強(qiáng)弱，后來還發(fā)現(xiàn)決定活性的種屬特異性。

美國 Coley's公司在1998-2000年間發(fā)現(xiàn)了首個具有高度免疫刺激活性的人CpG基序 GTCGTT， Coley's公司根據(jù) GTCGTT 設(shè)計(jì)了 CpG-2006 (又名 CpG-7909)。同時，研究還發(fā)現(xiàn)了另一個活性相似的 人 CpG 基 序GTCGTC。與小鼠 CpG 基序不同，這兩個人源CpG 基序 5' 端第二位為嘧啶，而不是嘌呤，從而表明存在種屬特異的 CpG 基序。通過比較不同突變體對人和小鼠免疫細(xì)胞的活性，最終確定活化人免疫細(xì)胞的CpG 基序?yàn)?TCGT，而活化小鼠免疫細(xì)胞的 CpG 基序?yàn)?A/TCGTT (5' 端第一位 A 活性強(qiáng)于 T) 。該發(fā)現(xiàn)不但修正了以前對CpG 基序的理解，更重要的是發(fā)現(xiàn)了對人和小鼠具有交叉免疫刺激活性的 CpG 基序 TCGTT，研究人員今后可以方便地使用小鼠模型來研究CpG的潛在臨床應(yīng)用價值。

CpG的種屬特異性

現(xiàn)已明確 TLR9 對CpG的識別是脊椎動物免疫系統(tǒng)識別病原微生物的一種先天性免疫應(yīng)答機(jī)制。物種分化、TLR9變異和自然選擇等因素共同作用導(dǎo)致不同物種通過各自的TLR9 變異體識別不同微生物來源的 CpG，其中人和小鼠 TLR9 在氨基酸水平上只有76%的同源性，因此不難理解自然界存在種屬特異的 CpG 基序及其識別機(jī)制。

最早研究發(fā)現(xiàn) GACGTT 和AACGTT 等CpG 基序具有很強(qiáng)的小鼠特異性，但對人免疫細(xì)胞的活性較弱。即使如此，Dynavax 公司在乙肝預(yù)防性疫苗的III期臨床研究中已證明含有AACGTT的CpG-1018具有良好的疫苗佐劑活性。然而這類序列用于人體臨床的劣勢在于所需劑量較大，每劑疫苗含有3 mg CpG-1018。

后來，Coley's 公司發(fā)現(xiàn)的GTCGTT 對人和小鼠具有交叉免疫刺激活性，隨后證明該序列對羊、馬、豬、狗、兔等其他物種也有廣泛免疫刺激活性。該序列的核心為人 CpG 基序 TCGT，因此對人免疫細(xì)胞具有很強(qiáng)的活性。Coley's 公司根據(jù) GTCGTT 設(shè)計(jì)了 CpG-7909，在乙肝預(yù)防性疫苗的I/II期臨床研究中證明每劑 0.125~1mg 的 CpG-7909 就具有良好的疫苗佐劑活性。相對于 CpG-1018，這類序列在臨床應(yīng)用中不但具有活性優(yōu)勢，還具有使用劑量低而更加經(jīng)濟(jì)安全的優(yōu)點(diǎn)。

此外，研究表明，CpG效應(yīng)細(xì)胞也具有種屬特異性，在小鼠中為單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和 B 細(xì)胞，在人體中為pDC和 B 細(xì)胞。CpG效應(yīng)細(xì)胞的種屬特異性提示動物模型研究結(jié)果并不一定能夠在人體臨床中得到重現(xiàn)。然而臨床研究表明 CpG是一種良好的疫苗佐劑，雖然人常規(guī)樹突狀細(xì)胞不表達(dá)TLR9，但CpG激活的pDC 和B 細(xì)胞具有足夠強(qiáng)大的抗原提呈能力；另一方面，CpG在小鼠中可激活單核/巨噬細(xì)胞誘生大量 TNF-α，從而產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用，而在人體中這些細(xì)胞并不表達(dá)TLR9，因此 CpG在人體中可能具有更好的安全性。

CpG疫苗佐劑的臨床研究

自2000年以來，已有20種以上 CpG佐劑疫苗陸續(xù)進(jìn)入臨床研究。這些研究涉及傳染病、腫瘤和過敏等疾病的預(yù)防性和治療性疫苗，使用的疫苗抗原主要為重組蛋白和合成多肽，使用的CpG主要為B型，如CpG-1018。

第一個完成III期試驗(yàn)的含CpG的疫苗是針對乙型肝炎病毒的HEPLISAV。此前批準(zhǔn)的HBV疫苗多是明礬佐劑疫苗，需要在6個月內(nèi)進(jìn)行三次免疫接種才能達(dá)到保護(hù)性抗體滴度。然而即使接種了完整系列的此種疫苗，仍有5-10%的免疫能力個體無法實(shí)現(xiàn)持久的血清保護(hù)。HEPLISAV中加入CpG可以改善針對HBV的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)。在III期臨床試驗(yàn)中，與明礬佐劑疫苗相比，HEPLISAV以更少的免疫接種引發(fā)了更高的血清保護(hù)性抗體滴度。美國食品和藥物管理局（FDA）于2017年批準(zhǔn)其用于預(yù)防所有已知的HBV亞型引起的18歲以上成年人感染。

CpG作為佐劑的瘧疾疫苗在美國、澳大利亞和馬里進(jìn)行了I期和IIa期試驗(yàn)。結(jié)果顯示，CpG使志愿者對瘧疾抗原產(chǎn)生了明顯更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。與單獨(dú)的抗原相比，CpG與抗原的結(jié)合使平均中和抗體滴度增加了六倍。這種增強(qiáng)的抗體反應(yīng)是持續(xù)的：在接種疫苗后236天，加CpG免疫的人群血清抗體滴度比單抗原免疫的人群仍高4.6倍。

涉及CpG的臨床試驗(yàn)數(shù)量最多的是在腫瘤學(xué)領(lǐng)域。一種主要的方法是將CpG與腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）或腫瘤細(xì)胞結(jié)合。例如，在黑色素瘤患者的MART-1肽疫苗中添加CpG導(dǎo)致抗原特異性CD8+T細(xì)胞的頻率增加10倍。在I/II期試驗(yàn)中，通過在MAGE-3疫苗中添加CpG，抗MAGE-3抗體滴度得到增強(qiáng)，其中一名患者產(chǎn)生了持久的客觀反應(yīng)。CpG也作為轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者的疫苗佐劑進(jìn)行研究。初步結(jié)果顯示，用自體腫瘤細(xì)胞、CpG和GM-CSF接種疫苗，然后用IFN-α和CpG維持治療，在七名患者中有三名病情部分緩解或穩(wěn)定。

游離CpG誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL的能力也在研究中。該概念涉及將CpG遞送給接受過細(xì)胞毒性腫瘤治療（包括放療、化療或使用單克隆抗體治療）的患者。在這種條件下，CpG促進(jìn)腫瘤細(xì)胞釋放的腫瘤抗原的攝取，并改善隨后的免疫反應(yīng)。對惡性膠質(zhì)瘤和淋巴瘤患者的初步研究支持TLR9激動劑可以協(xié)同增強(qiáng)傳統(tǒng)的抗腫瘤策略的療效。迄今為止，這種組合顯示出良好的臨床益處和安全性。

CpG的另一種給藥方法涉及腫瘤內(nèi)注射。該策略旨在激活癌癥微環(huán)境中存在的DC，從而促進(jìn)原位抗原的呈遞。在進(jìn)行的幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)中， CpG在腫瘤內(nèi)遞送以治療惡性皮膚腫瘤或淋巴瘤，這些試驗(yàn)產(chǎn)生了有希望的結(jié)果。這種策略在一半的基底細(xì)胞癌或黑色素瘤患者中誘導(dǎo)了腫瘤的完全或部分緩解，腫瘤內(nèi)給予CpG（單獨(dú)或與放射治療聯(lián)合）通過改善淋巴瘤和黑色素瘤病人中腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生，誘導(dǎo)了全身腫瘤消退。

安全性方面，CpG 佐劑會引起輕微至中度的副反應(yīng)，包括注射位點(diǎn)疼痛、腫脹、硬結(jié)、紅疹等局部反應(yīng)以及流感樣癥狀等系統(tǒng)癥狀，幾天內(nèi)會得到緩解，可能是由其免疫刺激特性導(dǎo)致的。

小結(jié)

在過去20-30年中，大量動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明 CpG是一種具有良好應(yīng)用前景的新型人用疫苗佐劑。與現(xiàn)有疫苗佐劑相比，CpG的作用機(jī)制更為明確，具有更強(qiáng)的疫苗佐劑活性，尤其是細(xì)胞免疫佐劑活性。此外，CpG-ODNs 可通過化學(xué)合成大規(guī)模生產(chǎn)，易于質(zhì)控，成本理想。隨著對不同來源 CpG 佐劑的安全性、有效性研究的廣泛、深入開展，研究數(shù)據(jù)的不斷積累也將提升研究者與監(jiān)管方對 CpG 的認(rèn)知，CpG終將成為一種理想的新型人用疫苗佐劑。

參考文獻(xiàn)：

1.Recent progress concerning CpG DNA and itsuse as a vaccine adjuvant. Expert Rev Vaccines.2014 Feb; 13(2): 299–312.

2. CpG-ODNs 疫苗佐劑的研究進(jìn)展

3. CpG ODN 佐劑的研究進(jìn)展及其藥學(xué)研究的思考

       原文標(biāo)題 : CpG疫苗佐劑的研究進(jìn)展