NRP1對(duì)CD8＋T細(xì)胞的影響

與NRP1在小鼠胸腺來(lái)源的Treg細(xì)胞上的結(jié)構(gòu)性表達(dá)不同，其在原始CD8＋T細(xì)胞上的表達(dá)是檢測(cè)不到的（無(wú)論是小鼠還是人類），其只在T細(xì)胞激活時(shí)才被誘導(dǎo)。CD8＋T細(xì)胞對(duì)NRP1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)是在使用LCMV特異性（P14）TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞對(duì)CD8＋T細(xì)胞分化的早期分子和功能分析中首次發(fā)現(xiàn)的，其中NRP1轉(zhuǎn)錄在效應(yīng)CD8＋T細(xì)胞和效應(yīng)器到記憶的過(guò)渡期達(dá)到峰值。Nrp1上調(diào)與一組編碼參與T細(xì)胞遷移和粘附的蛋白質(zhì)的基因相一致，如CCR5、CD44和p－選擇素糖蛋白配體1（PSGL－1）。這就提出了一個(gè)問(wèn)題：NRP1是否也像在神經(jīng)元或內(nèi)皮細(xì)胞中一樣調(diào)節(jié)CD8＋T細(xì)胞的遷移。與這一發(fā)現(xiàn)相一致，研究人員還觀察到多克隆腫瘤內(nèi)效應(yīng)CD8＋T細(xì)胞以及激活的腫瘤抗原特異性CD8＋T細(xì)胞上NRP1表達(dá)的上調(diào)（包括轉(zhuǎn)錄和蛋白水平）。因此，TCR參與似乎是推動(dòng)NRP1在CD8＋T細(xì)胞中表達(dá)的必要條件，這是大多數(shù)已知的T細(xì)胞共受體所共有的特征。然而，盡管觀察到上調(diào)，NRP1在CD8＋T細(xì)胞早期啟動(dòng)過(guò)程中的功能作用尚不清楚。

一些早期觀察表明NRP1可能是CD8＋T細(xì)胞中的一種IR樣分子。它首先在免疫抑制的腸道CD8＋T細(xì)胞亞群（Foxp3＋CD8＋Treg細(xì)胞）以及已知與CD4＋Treg細(xì)胞相關(guān)的分子（如PD1和CD103）上被高度誘導(dǎo)。這些CD8＋Treg細(xì)胞可能通過(guò)下調(diào)T細(xì)胞的效應(yīng)器功能來(lái)維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。在隨后的報(bào)告中，使用Gag特異性（TCRGag）CD8＋T細(xì)胞來(lái)了解調(diào)節(jié)CD8＋T細(xì)胞耐受性和免疫性的細(xì)胞內(nèi)在機(jī)制，經(jīng)測(cè)定，和PD1、LAG3和CTLA4一樣，NRP1優(yōu)先表達(dá)于耐受性、自反應(yīng)性CD8＋T細(xì)胞上，盡管NRP1對(duì)于耐受性是不必要的。另外的證據(jù)表明NRP1可能在T細(xì)胞功能障礙中起作用，T細(xì)胞功能障礙是指由于缺乏共刺激或持續(xù)的抗原暴露而導(dǎo)致T細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)或衰竭。T細(xì)胞功能障礙表現(xiàn)為高IR共表達(dá)和效應(yīng)標(biāo)記物表達(dá)減少，研究發(fā)現(xiàn)NRP1屬于上述所有T細(xì)胞功能障礙狀態(tài)共有的174個(gè)基因的核心轉(zhuǎn)錄特征。

事實(shí)上，最近的一項(xiàng)報(bào)告表明，CD8＋T細(xì)胞NRP1在小鼠和人類中的表達(dá)僅限于以PD1高表達(dá)為標(biāo)志的腫瘤內(nèi)CD8＋T細(xì)胞亞群，而在PD1－瘤內(nèi)CD8＋T細(xì)胞上檢測(cè)到NRP1＋T細(xì)胞最少。與NRP1－PD1－和NRP1－PD1＋對(duì)應(yīng)物相比，NRP1＋PD1hi細(xì)胞表現(xiàn)出較高的經(jīng)典IRs（如LAG3、TIM3、TIGIT、2B4）以及與細(xì)胞增殖相關(guān)的標(biāo)記物（如Ki67）和細(xì)胞毒性（如Granzyme B）。它們還表達(dá)較高水平的耗竭相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如NFATc1、TOX、Blimp1和IRF4，但與細(xì)胞存活（Bcl2）和記憶／衰竭前體細(xì)胞（TCF1）相關(guān)的基因水平降低。這非常容易令人想起在慢性病毒感染和腫瘤模型中定義的“終末期衰竭”CD8＋T細(xì)胞。重要的是，NRP1在功能上參與了腫瘤內(nèi)CD8＋T細(xì)胞的終末衰竭，而不僅僅是這種功能障礙狀態(tài)的后果。具體而言，從B16F10腫瘤中回收的CD8＋T細(xì)胞經(jīng)中和抗NRP1抗體處理后，表達(dá)更高水平的穿孔素和顆粒酶B（介導(dǎo)CD8＋T細(xì)胞毒性活性的關(guān)鍵分子），并且對(duì)體外自體腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用。在同一研究中，體內(nèi)NRP1阻斷導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)減少，這與PD1阻斷進(jìn)一步協(xié)同作用，盡管這種協(xié)同作用在體外沒(méi)有觀察到增強(qiáng)的細(xì)胞毒性活性。體內(nèi)和體外的差異可能是由于通過(guò)阻斷Sema3A–NRP1軸來(lái)增強(qiáng)新近激活的CD8＋T細(xì)胞的腫瘤募集。重要的是，在體內(nèi)抗NRP1方案下，除了CD8＋T細(xì)胞外，阻斷NRP1對(duì)細(xì)胞類型（如Treg細(xì)胞）也可能有貢獻(xiàn)。實(shí)際上，后者似乎得到了利用CD8＋T細(xì)胞特異性Nrp1缺陷小鼠株（E8ICreNrp1L／L）的研究的支持，這種小鼠的原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)與野生型相似。然而，在E8ICreNrp1L／L小鼠中，還觀察到在MC38結(jié)腸腺癌模型中，Nrp1基因敲除和PD1阻斷之間存在明顯的協(xié)同作用，進(jìn)一步支持了Nrp1有助于缺陷的CD8＋T細(xì)胞介導(dǎo)的原發(fā)性腫瘤控制，盡管作用是間接的。

事實(shí)上，E8ICreNrp1L／L小鼠最顯著的表型是在術(shù)后腫瘤免疫小鼠模型中，它們對(duì)繼發(fā)性腫瘤的作用增強(qiáng)。這項(xiàng)觀察表明，NRP1在CD8＋T細(xì)胞中的主要作用可能是它有助于缺陷的CD8＋T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫記憶。具有臨床意義的是，這種模式類似于癌癥患者疾病復(fù)發(fā)的控制。進(jìn)一步的研究顯示，Nrp1–／–腫瘤內(nèi)CD8＋T細(xì)胞更能維持類似干細(xì)胞的記憶／衰竭性T細(xì)胞祖細(xì)胞表型，而不是最終衰竭T細(xì)胞表型的不可逆分化。因此，這些Nrp1–／–記憶前體形成了一個(gè)更大的腫瘤特異性記憶CD8＋T細(xì)胞池，這種情況在通過(guò)基因缺陷或抗體在阻斷任何其他IRs時(shí)都沒(méi)有報(bào)道。

與效應(yīng)CD8＋T細(xì)胞相比，NRP1在記憶性CD8＋T細(xì)胞上的表達(dá)在不同的研究中有很大差異。在急性病毒感染期間，與效應(yīng)T細(xì)胞相比，長(zhǎng)效記憶細(xì)胞的Nrp1基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)（盡管比原始細(xì)胞高）。這種Nrp1表達(dá)下調(diào)在腫瘤特異性記憶CD8＋T細(xì)胞上更為顯著，其中Nrp1轉(zhuǎn)錄在初始細(xì)胞中降低到基線水平。與這些觀察結(jié)果相反，一份報(bào)告將NRP1描述為在非炎癥條件下通過(guò)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞交叉呈遞抗原產(chǎn)生的肝啟動(dòng)記憶CD8＋T細(xì)胞的表面標(biāo)記物，然而，對(duì)于這些記憶性CD8＋T細(xì)胞來(lái)說(shuō)，這在功能上是不必要的。這些研究之間的差異可以部分地由產(chǎn)生功能性記憶的不同體內(nèi)條件（例如炎癥環(huán)境和抗原類型）來(lái)解釋。因此，NRP1在記憶CD8＋T細(xì)胞（其他IRs可能也一樣）上的表達(dá)是由記憶形成過(guò)程中的環(huán)境決定的。

綜上所述，NRP1在CD8＋T細(xì)胞中的進(jìn)化生物學(xué)支持了存在獨(dú)立的IRs或免疫“檢查點(diǎn)”的假設(shè)，它們分別控制腫瘤內(nèi)CD8＋T細(xì)胞的效應(yīng)和記憶功能。進(jìn)一步的機(jī)制解釋這一假設(shè)是至關(guān)重要的，希望可以提高T細(xì)胞靶向免疫治療的持久性，包括免疫檢查點(diǎn)阻斷和過(guò)繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

NRP1靶向治療腫瘤：新一代的檢查點(diǎn)分子

NRP1的臨床研究主要集中在其作為VEGFR2的共受體對(duì)腫瘤血管生成的貢獻(xiàn)上，而不是通過(guò)結(jié)合信號(hào)素或其他配體的免疫調(diào)節(jié)功能�？筃RP1單克隆抗體（MNRP1685A）的初始藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，與抗VEGF－A的bevacizumab聯(lián)合使用，可有效抑制人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子途徑。然而，隨后在I期研究中進(jìn)行的安全性分析顯示出高水平的不良事件，最顯著的是2級(jí)或3級(jí)蛋白尿出現(xiàn)在超過(guò)50％的受試者，最終終止了對(duì)這種藥物的治療研究。最近對(duì)抗VEGFR2藥物ramucirumab的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，對(duì)Treg細(xì)胞有顯著影響，為推測(cè)NRP1功能和表達(dá)是否對(duì)觀察結(jié)果有貢獻(xiàn)留下了空間。

迄今為止，只有一種抗NRP1單克隆抗體被臨床評(píng)估其對(duì)Treg細(xì)胞功能的抑制作用。ASP1488（人IgG4，Astellas Pharma Inc．）聯(lián)合Nivolumab正在進(jìn)行Ib期評(píng)估（NCT03565445），用于晚期實(shí)體瘤患者。這項(xiàng)試驗(yàn)的結(jié)果預(yù)計(jì)將在2022年得出，這將是進(jìn)一步評(píng)估靶向NRP1的臨床意義和潛力的關(guān)鍵。免疫監(jiān)測(cè)Treg細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的變化，即使是在病人的外周，也可以為治療反應(yīng)和作用機(jī)制提供信息。

除此之外，對(duì)NRP1靶向治療的潛在結(jié)果的觀察也可以間接地從研究信號(hào)素家族（涉及其免疫調(diào)節(jié)的主要NRP1配體群）的靶向治療上獲得。為此，盡管T細(xì)胞上NRP1的主要配體Sema4A尚未在臨床上被靶向，但是針對(duì)Sema3A（已知的NRP1配體）的藥物的臨床前評(píng)估已經(jīng)取得了令人滿意的結(jié)果。Sema3A被認(rèn)為是一種血管系統(tǒng)正�；�因子，它與NRPs和叢蛋白相互作用。盡管多項(xiàng)研究表明Sema3A的功能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，但是最近一項(xiàng)針對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究表明，在患者衍生的異種移植（PDX）模型中，Sema3A的中和作用阻礙了腫瘤的生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)之間的差異仍有待研究；但是，不同腫瘤類型的腫瘤血管需求和免疫浸潤(rùn)的差異可能決定了Sema3A是否具有促腫瘤或抗腫瘤功能。事實(shí)上，Sema3A內(nèi)在調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活，因此，治療性阻斷這種相互作用可能介導(dǎo)增強(qiáng)的抗腫瘤免疫。

已有的小分子或肽拮抗劑主要針對(duì)b1結(jié)構(gòu)域與VEGF－A的相互作用，以減少腫瘤細(xì)胞的遷移和血管生成，而新的候選藥物似乎還可以在體外內(nèi)在地調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的功能，這種組合作用可能允許降低劑量來(lái)減輕潛在的副作用。盡管人類Treg細(xì)胞在腫瘤中選擇性地表達(dá)NRP1，使其成為一個(gè)有吸引力的腫瘤特異性免疫靶點(diǎn)，但NRP1是由造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞亞群（包括pDCs和內(nèi)皮細(xì)胞）結(jié)構(gòu)性表達(dá)的。因此，靶向NRP1的藥物在穩(wěn)態(tài)和疾病狀態(tài)下對(duì)這些細(xì)胞類型功能的影響將進(jìn)一步確定其臨床適用性。

展望

越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明，NRP1是癌癥免疫治療中一種獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)劑。在TME中，NRP1內(nèi)在地調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞功能，共同阻礙抗腫瘤免疫，并與多個(gè)IRs同時(shí)表達(dá)。NRP1有利于腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的功能，這主要是通過(guò)促進(jìn)它們?cè)谀[瘤床上的募集和在持續(xù)的炎癥中增強(qiáng)其功能穩(wěn)定性。惡性腫瘤患者的NRP1＋Treg細(xì)胞豐度較高，治療干預(yù)與外周Treg細(xì)胞NRP1表達(dá)降低有關(guān)。雖然NRP1對(duì)CD8＋T細(xì)胞效應(yīng)器功能影響較小，但與其他IRs相比，NRP1對(duì)記憶形成和持久反應(yīng)的影響是不同的。這些新的特點(diǎn)可能轉(zhuǎn)化為與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的檢查點(diǎn)抑制劑并不重疊的臨床療效，從而為聯(lián)合治療提供了有根據(jù)的理論依據(jù)。

隨著越來(lái)越多的對(duì)NRP1的免疫調(diào)節(jié)作用的關(guān)注，利用靶向NRP1來(lái)改善腫瘤治療的機(jī)會(huì)在增加，而關(guān)于NRP1基本生物學(xué)和轉(zhuǎn)化應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題仍然存在。

我們能否進(jìn)一步了解NRP1在T細(xì)胞亞群（即Treg細(xì)胞、CD4＋和CD8＋T細(xì)胞）中的分子基礎(chǔ)，特別是在人類中？這些機(jī)制的描述對(duì)于制定特定的干預(yù)策略、促進(jìn)組合免疫療法的優(yōu)化設(shè)計(jì)以及減少治療引起的免疫相關(guān)不良事件的方法至關(guān)重要。

在眾多的NRP1配體中，哪一種與腫瘤內(nèi)的Treg細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞最相關(guān)？這一問(wèn)題的答案將有助于明確靶向相關(guān)腫瘤相關(guān)的NRP1－配體相互作用的阻斷策略，同時(shí)保留NRP1的生理功能。

NRP1靶向治療方法能否提供新的策略來(lái)提高過(guò)繼性T細(xì)胞治療的持久性，如嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞治療？在這種情況下，NRP1可能是一個(gè)可行的基因靶點(diǎn)，以克服CD8＋T細(xì)胞功能障礙，并提高體內(nèi)反應(yīng)持續(xù)時(shí)間。

NRP1拮抗劑對(duì)TME中包括APCs和間質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的其他細(xì)胞的功能有內(nèi)在的影響嗎？如果是這樣的話，是否有增強(qiáng)抗腫瘤免疫的作用？

與標(biāo)準(zhǔn)的免疫檢查點(diǎn)治療相結(jié)合，如抗PD1／PD－L1抑制劑，是否能達(dá)到更好的臨床療效？最佳給藥方案是什么？

人外周血T細(xì)胞（Tregs或CD8＋細(xì)胞）上的NRP1能否作為診斷腫瘤的標(biāo)志物？它能被用來(lái)確定免疫治療的最佳候選者或評(píng)估治療效果嗎？

參考文獻(xiàn)：

Neuropilin－1： a checkpoint target with unique implications for cancer immunology and immunotherapy． Trends Immunol． 2020 Jun；41（6）：493－511