前言

固有免疫系統(tǒng)維持著一種完美的平衡，在健康組織中保持靜止，而面對(duì)致病性刺激時(shí)可以迅速激活。巨噬細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵效應(yīng)分子，隨時(shí)檢測著激活和抑制信號(hào)，以啟動(dòng)吞噬和分泌細(xì)胞因子的功能。

細(xì)胞表面蛋白CD47是一種“不要吃我”的信號(hào)，它保護(hù)健康細(xì)胞不被巨噬細(xì)胞吞噬，缺乏CD47的造血細(xì)胞會(huì)被巨噬細(xì)胞迅速吞噬并觸發(fā)樹突狀細(xì)胞的活化。CD47在癌細(xì)胞上的表達(dá)通常會(huì)增加，作為逃避免疫檢測的一種機(jī)制。CD47的阻斷性抗體會(huì)抑制腫瘤的生長甚至徹底清除腫瘤。
靶細(xì)胞表面的CD47會(huì)被巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞上的SIRPA（信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白?）識(shí)別。SIRPA是一種含有多重細(xì)胞內(nèi)基于酪氨酸的免疫抑制基序（ITIMs）的抑制性受體。缺乏SIRPA的巨噬細(xì)胞對(duì)攜帶CD47的靶細(xì)胞的吞噬作用不明顯，這表明SIRPA是CD47信號(hào)的主要感受器。SIRPA必須以高度精確的方式來激活，以保證在CD47存在時(shí)抑制對(duì)活細(xì)胞的吞噬，而對(duì)缺乏CD47的靶點(diǎn)進(jìn)行強(qiáng)有力的吞噬。CD47通過Src家族的激酶觸發(fā)SIRPA磷酸化，磷酸化的SIRPA招募磷酸酶SHP－1和SHP－2，但是CD47如何驅(qū)動(dòng)SIRPA磷酸化以及這些磷酸酶的下游靶點(diǎn)及其與吞噬過程的關(guān)系還不清楚。了解CD47－SIRPA抑制吞噬的作用機(jī)制對(duì)癌癥免疫治療的應(yīng)用具有重要意義。
CD47抑制IgG和磷脂酰絲氨酸“吃我”信號(hào)

為了研究吞噬過程中“吃我”和“不要吃我”信號(hào)整合的機(jī)制，研究人員使用了一個(gè)重組的吞噬靶標(biāo)。這個(gè)靶標(biāo)是將硅珠包裹在一個(gè)支持的脂質(zhì)雙層膜上，以模擬癌細(xì)胞的表面。為了激活SIRPA，研究人員將CD47胞外結(jié)構(gòu)域按一定的密度（～600分子／mm2）整合來模擬癌細(xì)胞上的CD47。

利用這個(gè)系統(tǒng)，測試了CD47對(duì)IgG和磷脂酰絲氨酸的吞噬作用�？梢园l(fā)現(xiàn)CD47抑制了中等IgG密度下的吞噬，但對(duì)高密度結(jié)合IgG的靶標(biāo)吞噬作用并不明顯。CD47的存在并沒有完全消除吞噬作用，而是導(dǎo)致開始吞噬的細(xì)胞比例和每個(gè)細(xì)胞被吞噬的小球數(shù)量的數(shù)量減少。這種抑制依賴于CD47的激活，因?yàn)橥蛔兊腃D47胞外結(jié)構(gòu)域不能與SIRPA結(jié)合（F37D，T115K），無法抑制吞噬。另外，含有10％磷脂酰絲氨酸的珠子的吞噬被包含在脂質(zhì)雙層上的CD47抑制。這些數(shù)據(jù)表明CD47－SIRPA信號(hào)可以阻斷IgG和磷脂酰絲氨酸驅(qū)動(dòng)的吞噬。CD47使SIRPA重新定位于吞噬突觸

為了確定CD47調(diào)節(jié)SIRPA活性的機(jī)制，研究人員首先檢查了SIRPA在IgG包被小球吞噬過程中的定位。當(dāng)SIRPA不與CD47結(jié)合時(shí)，SIRPA與包裹IgG包被小球的吞噬杯分離。相反，在CD47的存在下，SIRPA仍停留在吞噬杯中。這些數(shù)據(jù)表明，未結(jié)合的SIRPA被排除在吞噬突觸之外，而CD47結(jié)合SIRPA后使其仍保留在吞噬突觸中。

在IgG和CD47缺失的情況下SIRPA從吞噬杯中分離的機(jī)制推測可能是由SIRPA高度糖基化的胞外結(jié)構(gòu)域驅(qū)動(dòng)的。為了驗(yàn)證這個(gè)想法，研究人員創(chuàng)建了一個(gè)SIRPA嵌合受體，其中胞外域被一個(gè)小的惰性蛋白結(jié)構(gòu)域取代（FRBEXTT－SIRPA）。與全長SIRPA不同，F(xiàn)RBEXT－SIRPA沒有與細(xì)胞靶向突觸分離。這一結(jié)果表明SIRPA的胞外結(jié)構(gòu)域是將SIRPA排除在吞噬突出之外所必需的。

SIRPA集中在免疫突觸抑制吞噬

SIRPA包含兩個(gè)免疫酪氨酸抑制基序（ITIMs），它們被Src家族激酶磷酸化，對(duì)下游信號(hào)傳遞至關(guān)重要。因此，可以推測將SIRPA定位在吞噬杯中可能驅(qū)動(dòng)ITIM磷酸化和受體激活。為了區(qū)分CD47結(jié)合和突觸定位的影響，研究人員開發(fā)了一種嵌合SIRPA受體，將SIRPA胞外結(jié)構(gòu)域替換為FcgR3a鏈的IgG結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域（FcR3EXT SIRPAINT），在CD47缺失的情況下定位于吞噬突觸。這種突觸定位嵌合體的表達(dá)抑制了IgG包被小球的吞噬。

作為對(duì)照，研究人員另外表達(dá)了一個(gè)嵌合結(jié)構(gòu)，其中ITIM結(jié)構(gòu)域的四個(gè)酪氨酸突變?yōu)楸奖�氨酸，抑制了SIRPA的磷酸化和激活（FcR3ext SIRPA 4Fint）。這種結(jié)構(gòu)不影響吞噬，表明SIRPA嵌合體的抑制作用是信號(hào)依賴的。因此，將SIRPA定位到吞噬杯足以抑制吞噬，即使在缺乏其天然配體CD47的情況下。

CD47抑制整合素活化

通過觀察巨噬細(xì)胞登陸脂質(zhì)雙層膜的動(dòng)力學(xué)，可以發(fā)現(xiàn)，IgG涂層的雙層膜上的細(xì)胞遍布雙層膜表面。相反，巨噬細(xì)胞遇到含有IgG和CD47的雙層膜時(shí)，細(xì)胞擴(kuò)散減少。靜態(tài)時(shí)間點(diǎn)的TIRF成像顯示，與含野生型CD47的雙層膜相互作用的巨噬細(xì)胞較少，相互作用的巨噬細(xì)胞足跡較小。這些數(shù)據(jù)表明，CD47抑制了巨噬細(xì)胞在靶向底物上的擴(kuò)散。

細(xì)胞擴(kuò)散被認(rèn)為涉及整合素和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的激活。未激活的整合素以低親和力、彎曲的形式存在。激活后，整合素的胞外結(jié)構(gòu)域會(huì)擴(kuò)展為開放構(gòu)象，可結(jié)合許多具有高親和力的配體。FcR激活會(huì)刺激整合素的由內(nèi)而外的活化。激活的整合素可通過增加與靶粒子的粘附力或提供細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和肌動(dòng)蛋白組裝來促進(jìn)吞噬。通過用β2整合素功能阻斷性抗體或Fab抑制整合素可顯著降低IgG介導(dǎo)的吞噬效率。

CD47－SIRPA信號(hào)是否是通過抑制整合素由內(nèi)到外的激活來抑制吞噬呢？為了驗(yàn)證這個(gè)想法，科研人員利用錳來處理巨噬細(xì)胞，而錳會(huì)將整合素鎖定為高親和力的開放構(gòu)象。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論CD47是否與支持的脂質(zhì)雙層膜結(jié)合，用1 mM錳包被的小球處理的巨噬細(xì)胞具有相似的效率。重要的是，錳本身不會(huì)引發(fā)吞噬，也不會(huì)在缺乏CD47的情況下顯著增強(qiáng)IgG包被小球的吞噬，從而證明增加整合素的活化以引發(fā)吞噬。因此，錳引起的吞噬增加對(duì)含有CD47和IgG的小球是特異的。

另一方面，通過用含有過量高親和力整合素配體ICAM－1的小球培養(yǎng)巨噬細(xì)胞。即使在CD47存在的情況下，ICAM－1也足以激活整合素，高濃度ICAM－1的加入消除了CD47對(duì)吞噬的抑制作用，但在沒有CD47的情況下，并沒有顯著改變IgG包被小球的吞噬效率。盡管存在CD47，但I(xiàn)CAM－1結(jié)合的珠子與缺乏CD47的珠子具有相似的肌動(dòng)蛋白積累水平。這表明激活整合素可以恢復(fù)巨噬細(xì)胞吞噬的能力。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明整合素的由內(nèi)而外的激活可能是CD47－SIRPA參與后抑制的主要靶點(diǎn)。