前言

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是免疫細(xì)胞的一小部分，專門(mén)用于抑制過(guò)度免疫激活和維持免疫穩(wěn)態(tài)。在過(guò)去二十年中，嵌合抗原受體（CAR）的開(kāi)發(fā)和基因組編輯的進(jìn)展促進(jìn)了T細(xì)胞治療的優(yōu)化， 這些技術(shù)現(xiàn)在被用于增強(qiáng)Treg細(xì)胞的特異性和功能性， 以Treg細(xì)胞為基礎(chǔ)的自身免疫和移植治療正得到快速的發(fā)展。

Treg的分類和功能

Treg是T細(xì)胞的一個(gè)子集， 占CD4＋T細(xì)胞總數(shù)的5－10％，具有維持體內(nèi)平衡和預(yù)防自身免疫的功能，其特征是CD4、CD25、FOXP3和低水平CD127的共同表達(dá)。高水平的FOXP3和特異性去甲基化區(qū)域（TSDR）的去甲基化是Treg的顯著特征，TSDR是FOXP3基因中的一個(gè)保守區(qū)域。

Tregs可分為兩類：天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（nTregs）和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（iTregs）。兩種類型的Tregs都普遍表達(dá) Foxp3。nTregs在胸腺中自然發(fā)育，其抑制作用是通過(guò)細(xì)胞間接觸實(shí)現(xiàn)的，它們的主要功能是維持正常的免疫耐受和控制炎癥反應(yīng)。

iTregs來(lái)源于腫瘤微環(huán)境信號(hào)誘導(dǎo)的外周原始T細(xì)胞，包括腫瘤抗原、細(xì)胞因子（如IL－10，TGF－β）和其他可溶性分子。iTregs通過(guò)多種促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制抑制效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）、NK細(xì)胞和DC的抗腫瘤免疫作用。

Tregs主要有以下五種功能機(jī)制：①Tregs分泌抑制性細(xì)胞因子，包括 IL－10、TGF－β 和 IL－35。②Tregs 通過(guò)顆粒酶和穿孔素殺死效應(yīng)細(xì)胞。③ Tregs 影響效應(yīng)細(xì)胞的功能：Treg 與效應(yīng)T細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)消耗 IL－2，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞的生長(zhǎng)；Tregs通過(guò)產(chǎn)生胞外酶CD39和CD73 促進(jìn)TME中腺苷的產(chǎn)生，誘效應(yīng)細(xì)胞導(dǎo)的抑制和抗增殖作用；Tregs通過(guò)縫隙連接將大量 cAMP 轉(zhuǎn)移到效應(yīng)T細(xì)胞，干擾其代謝。④Tregs通過(guò)刺激性和抑制性受體（CTLA－4 或 LAG3）誘導(dǎo)DC耐受，后者通過(guò)IDO進(jìn)一步抑制T細(xì)胞的能力。⑤MDSCs和Tregs 產(chǎn)生的因子形成正反饋環(huán)，促進(jìn)增殖，增強(qiáng)抑制環(huán)境。      

此外，一項(xiàng)研究使用一種新的策略來(lái)定義Tregs， Th1樣Tregs（T－ 234bet＋I(xiàn)FNγ＋Foxp3＋），Th2 樣Tregs（Gata3＋I(xiàn)RF4＋I(xiàn)L4＋Foxp3＋）和Th17樣Tregs（IL－17＋RORγt＋Foxp3＋），這為靶向 Tregs 治療提供了新思路。

過(guò)繼性Treg：從多克隆到抗原特異性

最初過(guò)繼性Treg的臨床試驗(yàn)主要使用多克隆或體外擴(kuò)增的Tregs。第一份關(guān)于用體外擴(kuò)增的Treg治療GVHD的報(bào)告表明，慢性GVHD患者的癥狀得到緩解，并有可能減少免疫抑制劑的使用。幾年后，11名接受干細(xì)胞移植治療惡性血液病的GVHD患者獲得了臍帶血來(lái)源的Treg，并進(jìn)行了擴(kuò)增和給藥。接受Treg治療的患者II－IV級(jí)急性GVHD的發(fā)病率降低5倍，Treg治療組一年后無(wú)慢性GVHD，而對(duì)照組為14％。

雖然多克隆Tregs獲得了一定程度令人鼓舞的效果，但是輸注所需的細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)大，此外，還有非特異性免疫抑制的風(fēng)險(xiǎn)，事實(shí)上，多克隆Tregs輸注后的病毒再激活已有報(bào)道。

這些缺點(diǎn)可以通過(guò)使用抗原特異性Treg來(lái)克服，與多克隆Treg相比，抗原特異性Treg只需要較少的細(xì)胞就可以實(shí)施更多的局部和靶向抑制。此外，許多研究已經(jīng)證明，在動(dòng)物模型中，特異于所需抗原的Treg在功能上優(yōu)于多克隆或未修飾的Treg。

傳統(tǒng)的產(chǎn)生抗原特異性Treg的方法主要依賴于用APCs和特異性抗原擴(kuò)增，或用T細(xì)胞受體（TCRs）工程化的Treg。然而，用APCs擴(kuò)增Treg效率低下，而用TCR構(gòu)建的Tregs（TCR－Tregs）仍然受到MHC的限制，限制了針對(duì)不同患者的模塊化應(yīng)用。

CAR－Treg的設(shè)計(jì)

另一種賦予Tregs特異性的方法是用CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞。與TCR－Treg相比，CAR具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：這些表達(dá)CARs的T細(xì)胞激活時(shí)繞過(guò)HLA限制，通過(guò)共受體信號(hào)的激活增加了特異性，以及CARs的靶向靈活性（任何可溶性或表面多價(jià)抗原都可以作為靶點(diǎn)）。

CAR－Treg細(xì)胞最直接的應(yīng)用是GvHD和器官移植排斥反應(yīng)。與大多數(shù)自身免疫性疾病不同，移植中有非常明確的靶點(diǎn)，即HLA分子。2016年，首次報(bào)道了HLA－A2CAR Treg細(xì)胞，研究證明，HLA－A2－CAR－Treg細(xì)胞抑制Teff細(xì)胞增殖，并在免疫缺陷NSG小鼠模型中阻止了HLA－A2＋PBMC介導(dǎo)的GvHD。

CAR－Treg細(xì)胞的新應(yīng)用仍在出現(xiàn)，B細(xì)胞靶向抗體受體（BAR）Treg細(xì)胞是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。人VIII因子（FVIII）注射液用于治療A型血友病患者，而隨著時(shí)間的推移，抗FVIII中和抗體的發(fā)展會(huì)導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率上升。含有FVIII免疫顯性結(jié)構(gòu)域（A2或C2）作為胞外結(jié)構(gòu)域的BAR被設(shè)計(jì)成靶向FVIII特異性B細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域仍為CD28－CD3ζ。引人注目的是，在體外，展示A2結(jié)構(gòu)域或C2結(jié)構(gòu)域的人BAR－Treg細(xì)胞抑制了用重組FVIII免疫的小鼠產(chǎn)生抗FVIII抗體。

CAR－Treg設(shè)計(jì)的另一個(gè)重要方面是共刺激領(lǐng)域的選擇。目前使用的共刺激域與傳統(tǒng)CAR－T細(xì)胞中使用的相同。雖然傳統(tǒng)T細(xì)胞和Treg通常表達(dá)相同的共刺激受體，但細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)不同，導(dǎo)致不同的效應(yīng)器功能。

到目前為止，大多數(shù)CAR－Treg的共刺激域是4－1BB或CD28。最近，人們研究了具有10個(gè)不同共刺激結(jié)構(gòu)域（例如CD28、CD28Y173F、ICOS、CTLA－4、CTLA－4 Y165G、PD－1、4－1BB、GITR、OX40、TNFR2）的第二代CAR－Treg，當(dāng)測(cè)試功能和基因表達(dá)譜時(shí)，表明CD28共刺激信號(hào)傳遞更優(yōu)越。使用4－1BB或TNFR2會(huì)導(dǎo)致Treg穩(wěn)定性和功能下降。

CAR－Treg在自身免疫疾病的研究進(jìn)展

GvHD

Treg治療已成為GvHD研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，大多數(shù)研究集中于體外擴(kuò)增的多克隆Treg。治療GvHD的Tregs的首次臨床試驗(yàn)顯示，對(duì)急性GvHD癥狀的影響不大，但顯著緩解了慢性GvHD的癥狀，并減少了免疫抑制劑的使用。

隨后的研究開(kāi)始使用CAR－Tregs，這是一種同種抗原特異性人類Tregs，被設(shè)計(jì)用于表達(dá)HLA－A2－特異性CAR。在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中，這些A2－CAR Treg保持FoxP3、CD25、Helios和CTLA－4的高表達(dá)。此外，他們?cè)诿庖呷毕菪∈竽Ｐ椭蓄A(yù)防了異種GvHD。

繼HLA－A2靶向CAR－Tregs成功后，最近的研究重點(diǎn)是產(chǎn)生具有不同靶向結(jié)構(gòu)域的CAR－Tregs，如CD83，其可在小鼠模型中預(yù)防GvHD。還有CD19，其可抑制B細(xì)胞抗體的產(chǎn)生和導(dǎo)致GvHD的病理學(xué)。

這些有希望的結(jié)果促成了在英國(guó)和美國(guó)對(duì)腎移植患者進(jìn)行的第一次CAR－Treg臨床試驗(yàn)（NCT04817774）授權(quán)。這項(xiàng)試驗(yàn)可能支持CAR－Tregs在臨床試驗(yàn)中優(yōu)于多克隆擴(kuò)增的Tregs，進(jìn)一步擴(kuò)大了在其他疾病條件下使用CAR－Tregs的可能性。其他生物制藥公司緊隨其后，例如Quell Therapeutics，專注于肝移植受者的CAR－Tregs。

糖尿病

1型糖尿病（T1D）是一種自身免疫性疾病，其特征是由于胰腺β細(xì)胞的破壞而導(dǎo)致胰島素缺乏。研究表明，T1D患者中Treg的免疫抑制功能降低。在動(dòng)物模型中，輸注擴(kuò)增的抗原特異性Treg在阻斷和逆轉(zhuǎn)糖尿病方面顯示出有希望的結(jié)果。然而，由于在循環(huán)中罕見(jiàn)，分離足夠多的抗原特異性Treg具有挑戰(zhàn)性。

因此，研究重點(diǎn)是用FoxP3基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的多克隆CD4＋T細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)化為T(mén)reg。此外，可通過(guò)工程化TCR或CAR技術(shù)將抗原特異性賦予多克隆T細(xì)胞。Brusko的研究小組發(fā)現(xiàn)，谷氨酸脫羧酶（GAD）特異性TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的Treg在體外可以抑制抗原特異性T細(xì)胞增殖的能力。另一項(xiàng)研究中，Hull等人將胰島特異性TCR轉(zhuǎn)移到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并證實(shí)其在體外具有抑制CD4和CD8 T細(xì)胞增殖的能力。目前，GentiBio和Abata等公司正在開(kāi)發(fā)TCR工程化Treg治療T1D。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是最常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)炎，其特征是滑膜炎癥、增生、自身抗體產(chǎn)生、軟骨和骨破壞。多種免疫細(xì)胞亞群參與RA的發(fā)展，其中，T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的相互作用起著至關(guān)重要的作用。

許多研究調(diào)查了增加Treg數(shù)量或改善Treg功能對(duì)RA的益處。Wright等人利用卵清蛋白（OVA）特異性Treg，通過(guò)產(chǎn)生TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的Treg或TCR－FoxP3轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4＋T細(xì)胞，來(lái)抑制OVA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。兩種工程化Treg均通過(guò)旁觀者抑制對(duì)不同抗原特異性T細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出OVA依賴性的抑制。目前，Sonoma Biotherapeutics公司正在開(kāi)發(fā)針對(duì)RA的CAR Treg療法。

多發(fā)性硬化癥

多發(fā)性硬化（MS）是一種自身免疫性脫髓鞘和神經(jīng)退行性疾病，由識(shí)別髓鞘表位的自身反應(yīng)性T細(xì)胞引起。使用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）模型進(jìn)行的臨床前研究證實(shí)了Tregs抑制抗原特異性自身反應(yīng)性免疫反應(yīng)的有效性。

Fransson等人用CAR靶向髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）創(chuàng)建抗原特異性Treg。MOG－CARTregs在體外抑制了效應(yīng)T細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)，MOG－CARTregs減少了EAE小鼠的疾病癥狀，并減少了腦組織中的促炎細(xì)胞因子mRNA水平。后來(lái)，Kim等人利用源自MS患者的髓鞘堿性蛋白特異性TCR構(gòu)建了Treg，在體內(nèi)TCR－Tregs顯著降低了EAE－MS小鼠模型中的疾病評(píng)分。免疫調(diào)節(jié)工程化Treg在臨床前研究中的結(jié)果，促進(jìn)了一些生物制藥公司的CAR－Treg的開(kāi)發(fā)，如Abata Therapeutics和TeraImmune。

炎癥性腸病

炎癥性腸病（IBD）是以胃腸道慢性炎癥為特征的疾病，潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩�。–D）是IBD最常見(jiàn)的形式。研究表明，腸道微生物群和免疫反應(yīng)之間的不平衡在IBD中起著重要作用。通常，腸道炎癥與Treg數(shù)量的減少無(wú)關(guān)。然而，Treg活性不足的小鼠更容易發(fā)生嚴(yán)重結(jié)腸炎。因此，多項(xiàng)研究試圖利用Treg抑制活性來(lái)維持UC的耐受性。

在一項(xiàng)研究中，來(lái)自轉(zhuǎn)基因小鼠的針對(duì)已知結(jié)腸炎抗原（TNP）的CAR－Tregs在體外抑制了效應(yīng)T細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)，誘導(dǎo)結(jié)腸炎后，與野生型動(dòng)物相比，觀察到CAR－Treg轉(zhuǎn)基因小鼠的存活率增加。此外，將TNP－CAR Tregs轉(zhuǎn)移到結(jié)腸炎小鼠模型中可以減少癥狀并提高存活率。基于CAR－Treg細(xì)胞的治療可能是緩解UC和CD的一種有前途的有效方式。

哮喘

哮喘是一種慢性呼吸道疾病，哮喘患者的Treg受損并減少。因此，新方法專注于通過(guò)在哮喘臨床前模型中轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)預(yù)防氣道炎癥。此外，一項(xiàng)研究利用調(diào)節(jié)T細(xì)胞表位（Tregitopes）誘導(dǎo)高度抑制性過(guò)敏原特異性Treg。

用Tregitopes治療可抑制過(guò)敏原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性和肺部炎癥。為了將Treg導(dǎo)向哮喘相關(guān)抗原，Skuljec等人應(yīng)用CAR技術(shù)，從轉(zhuǎn)基因小鼠中分離出針對(duì)CEA的第二代Treg，CEA是一種存在于肺和胃腸道腺上皮表面的糖蛋白。他們的結(jié)果顯示了哮喘小鼠炎癥肺中CEA－CAR Tregs的激活和歸巢。此外，與未修飾的Tregs相比，CEA－CAR Tregs在更大程度上改善了炎癥。

下一代工程化Treg

合成生物學(xué)

開(kāi)發(fā)Treg細(xì)胞作為治療自身免疫性疾病的藥物并不僅局限于TCRs和CARs的應(yīng)用，合成免疫學(xué)已經(jīng)產(chǎn)生了許多人工受體和系統(tǒng)，正在Treg細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)試。

這些系統(tǒng)包括通過(guò)連接的單鏈抗體將內(nèi)源性TCR復(fù)合物招募到非MHC靶點(diǎn)的T細(xì)胞抗原偶聯(lián)劑，可以被可溶性配體結(jié)合并激活的CARs，以及可分開(kāi)的、通用和可編程的CAR（SUPRA）。

細(xì)胞因子

毫無(wú)疑問(wèn)，細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。Treg細(xì)胞組成性地表達(dá)IL－2受體的高親和鏈CD25，有效地剝奪Teff細(xì)胞的IL－2。此外，通過(guò)工程化CAR－Treg細(xì)胞的改造，可以將促炎細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)化為IL－2或IL－10信號(hào)以增加對(duì)炎癥的抑制。

基因編輯一些利用CRISPR–Cas9編輯人類T細(xì)胞基因的臨床前研究已有發(fā)表，這些包括敲除CD4＋T細(xì)胞中CCR5的基因，產(chǎn)生抗HIV感染的T細(xì)胞；敲除CD7－CAR T細(xì)胞中CD7的基因，因?yàn)門(mén)細(xì)胞本身表達(dá)CD7，從而防止自相殘殺；以及敲除CD19－CAR T細(xì)胞中PD1的基因，從而提高人源化小鼠模型的腫瘤清除率。提升遞送系統(tǒng)

目前，CAR T細(xì)胞的制造使用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將遺傳物質(zhì)傳遞并整合到T細(xì)胞中。然而這些方法費(fèi)時(shí)、昂貴且有安全問(wèn)題的困擾。

一些非病毒的遞送方法正在開(kāi)發(fā)中，例如CRISPR－RNPs共電轉(zhuǎn)，可以將超過(guò)1 kb的DNA敲入人T細(xì)胞的特定基因組位點(diǎn)，這種方法簡(jiǎn)單，安全，雙鏈DNA模板沒(méi)有毒性。利用該方法糾正了單基因自身免疫性疾病患者細(xì)胞中的致病性CD25突變，證明了其潛在的應(yīng)用價(jià)值，但是這種方法也受到插入片段大小的限制。

設(shè)計(jì)Treg細(xì)胞

Treg細(xì)胞治療面臨的一個(gè)障礙是確保細(xì)胞在輸注后的存活，利用基因編輯敲除Treg細(xì)胞中JNK1基因可使其抗凋亡，JNK1缺陷的Treg細(xì)胞分泌更高水平的IL－10和TGFβ ，可以保護(hù)移植胰島不受排斥反應(yīng)的影響比對(duì)照延長(zhǎng)100天。

此外，Treg細(xì)胞在炎癥環(huán)境中也可能變得不穩(wěn)定，并轉(zhuǎn)化為致病性TH17細(xì)胞。通過(guò)敲除PRKCQ基因，可以降低了Treg細(xì)胞向TH17細(xì)胞分化的傾向，同時(shí)保持了Treg細(xì)胞的抑制功能。

最后，通過(guò)基因編輯獲得最新一代低免疫原性人多能干細(xì)胞，再加上不斷的努力將干細(xì)胞分化為T(mén)reg細(xì)胞，這可能會(huì)徹底改變工程化Treg細(xì)胞治療的手段。

小結(jié)

目前，利用Treg細(xì)胞設(shè)計(jì)治療自身免疫疾病正方興未艾，工程化CAR－Treg在這方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具有極大的潛力。然而，在Treg細(xì)胞生物學(xué)和Treg細(xì)胞治療領(lǐng)域仍存在許多問(wèn)題。

在接下來(lái)的十年中，隨著這些懸而未決的問(wèn)題的解決，期待看到Treg細(xì)胞制造的持續(xù)改進(jìn)，以及與合成生物學(xué)和基因編輯的廣泛應(yīng)用，將使Treg細(xì)胞療法發(fā)揮出越來(lái)越重要的作用。

參考文獻(xiàn)：

1． The Future ofRegulatory T Cell Therapy： Promises and Challenges of Implementing CARTechnology． Front Immunol． 2020； 11： 1608．

2． Chimeric AntigenReceptor （CAR） Treg： A Promising Approach to Inducing Immunological Tolerance．Front Immunol． 2018 Oct 12；9：2359．

3． Next－generation regulatory T cell therapy． Nat Rev Drug Discov． 2019 October ； 18（10）： 749–769．

4． Chimeric Antigen Receptor （CAR） Regulatory T－Cells in Solid OrganTransplantation． Front Immunol．2022； 13： 874157．

5． CAR－T Regulatory （CAR－Treg） Cells：Engineering and Applications． Biomedicines． 2022 Feb；10（2）： 287．

       原文標(biāo)題 : Treg的未來(lái)：CAR-Treg