前言

在過去十年中，自體CAR－T療法徹底改變了血液腫瘤的治療模式。目前，全球已有8種不同的CAR－T療法獲得市場授權，用于治療多發(fā)性骨髓瘤（MM）和CD19＋B細胞惡性腫瘤。然而，盡管CAR－T在復發(fā)和難治性血液瘤中取得了臨床成功，但仍然面對著一些挑戰(zhàn)，如繁瑣高昂的制造成本和高毒性，以及許多患者的復發(fā)及耐藥。

隨之孕育而生的是CAR－NK細胞免疫療法，作為一種更安全、更快、成本效益更高的方法出現，沒有CAR－T細胞的嚴重毒性跡象。由于NK細胞獨特的生物學特性和多種作用機制，使CAR－NK細胞治療成為強有力的臨床候選。

大量的CAR－NK臨床前研究已被證明在癌癥治療中有效，尤其是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中。到目前為止，有31項臨床試驗探索了11種不同的CAR靶點，包括CD19、CD20、CD22、NKG2D、CD33和BCMA等。在慢性淋巴細胞白血�。–LL）和難治性和復發(fā)性淋巴瘤（NCT03056339）中，雙順反子CD19－CD28－ζCAR／IL－15 UCB NK細胞獲得了令人印象深刻的反應（ORR：73％；CR：64％）。

盡管有多種優(yōu)勢，CAR－NK治療仍需面對許多挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)可能會引發(fā)耐藥性并影響其療效。因此，我們需要關注這些機制，特別是導致血液腫瘤逃避免疫監(jiān)測的CAR－NK功能障礙，從而制定有效策略克服CAR－NK功能衰竭和遷移障礙，保證CAR－NK效應的持久性。

制造條件：CAR－NK治療效果的關鍵因素

過繼細胞治療的主要問題之一是需要大量具有潛在增殖能力的增強功能效應細胞，以獲得最佳臨床反應。因此，優(yōu)化來源、細胞因子啟動和擴增方案可以保證CAR－NK細胞的細胞毒性和體內持久性。

細胞因子啟動和擴增

用作開發(fā)CAR－NK治療平臺的最常見來源包括來自PB或UCB的NK細胞、NK細胞系（如NK92）和來自IPSC、HESC或CD34＋造血干細胞的干細胞衍生NK細胞。

關于NK細胞啟動和擴增策略，大多數基于可溶性細胞因子和人工抗原呈遞細胞（aAPC）與膜結合分子（如細胞因子和／或共刺激配體）的使用。常見的γ鏈細胞因子IL－2、IL－7、IL－15和IL－21，以及其他如IL－12或IL－18，單獨或聯(lián)合使用。如使用經基因修飾以表達膜結合IL－15或IL－21和4－1BBL的飼養(yǎng)細胞可大大提高擴增倍率，同時保持NK和CAR－NK細胞的細胞毒性潛能。

此外，由于細胞因子自身的系統(tǒng)給藥可能產生不期望的效果，最新的工程方法側重于原位遞送和利用細胞因子信號，以延長NK／CAR－NK細胞的持續(xù)性，同時保持其優(yōu)化的功能。例如，一種分泌IL－15的CD19 CAR－UCB－NK細胞，該細胞在體外顯示出增強的細胞毒性，并在I／II期臨床試驗中顯示了CAR－NK的持續(xù)性，而患者體內沒有系統(tǒng)性IL－15水平升高（NCT03579927）。

自殺傾向降低NK細胞功效

NK細胞體外擴增可能導致一種“自殺”的不良現象，細胞識別其它同類細胞表面的受體或配體，并觸發(fā)針對它們的細胞毒性活性。在NK或CAR－NK細胞擴增過程中，有幾種機制可能導致自相殘殺。

其中，眾所周知的Fas／FasL軸是最相關的機制之一。FasL介導的細胞毒性在NK細胞功能中起關鍵作用，因為當其與靶細胞中的受體Fas結合時，它觸發(fā)caspase依賴性凋亡。Fas也可以作為抑制NK細胞活性的穩(wěn)態(tài)機制由NK細胞表達，稱為活化誘導細胞死亡（AICD）。據報道，其表達在NK細胞擴增過程中可能異常增加，特別是在IL－2、IL－15后或特定飼養(yǎng)細胞如K562－mIL21存在下培養(yǎng)時，導致自相殘殺。

另一種可能導致NK細胞間自相殘殺的受體是NKG2D。NKG2D是一種天然受體，主要由NK、CD8＋T和γδT細胞表達，識別多種應激誘導配體。有越來越多的數據描述活化的NK細胞有NKG2D－L表達，但其來源和對NK細胞功能的影響仍有爭議。

在CAR－NK細胞中，由于CAR配體／抗原識別，也可能出現自相殘殺。例如CD38 CAR－NK細胞，因為NK細胞自然表達CD38，并且在存在IL－2或工程飼養(yǎng)細胞的情況下，其表達可在體外擴增期間上調。因此，NK細胞可能被抗CD38 CAR識別而破壞。

T細胞同種異體排斥反應

宿主免疫系統(tǒng)對供體NK細胞的識別和排斥可能潛在地減少同種異體CAR－NK細胞在臨床環(huán)境中的持續(xù)性。負責這些機制的主要效應器是同種異體反應性T細胞，其識別同種異體NK細胞上的非自身HLA分子。

去淋巴化療誘導宿主免疫系統(tǒng)的短暫降低，從而改善過繼細胞植入。除了減少T細胞和NK細胞外，淋巴細胞減少藥物還減少了具有免疫抑制特性的細胞群，如Treg和骨髓源性抑制細胞（MDSC），為過繼性細胞擴增創(chuàng)造了更有利的微環(huán)境。

目前，正在開發(fā)其他策略以防止宿主系統(tǒng)排斥。如在人類PB－NK細胞中，通過靶向β－2－微球蛋白基因（β2M）來破壞HLAI類表達，以規(guī)避CD8＋T細胞同種異體反應性。

克服衰老：增強CAR－NK免疫療效

在缺乏細胞因子支持的情況下，NK細胞的體內壽命較短，降低了非腫瘤靶向毒性和致瘤風險，但也縮小了治療窗口。過繼轉移后NK細胞的體內持久性和增殖已顯示與臨床反應相關。因此，由于CAR－NK細胞的體內低持續(xù)性可能導致早期復發(fā)。此外，短的壽命也限制了NK細胞在制造過程中的體外增殖和擴增，使其難以獲得足夠的細胞數量，并縮短了通過基因工程優(yōu)化NK細胞的時間。因此，延長壽命可以提高CAR－NK細胞的功效。

與可以持續(xù)數月乃至數年的T細胞不同，人類NK的壽命沒有明確定義，在不同亞群之間存在差異，并且可以在體外進行操縱。在體內，成熟NK細胞需要持續(xù)的細胞因子支持，沒有這種支持，它們在循環(huán)中只能維持1－2周。當CAR－NK被工程化以表達IL－15時最高存活可達68天。然而，盡管允許通過外源性細胞因子或HLA匹配來改變壽命，但NK和CAR－NK是受衰老影響的短命細胞，衰老不可避免地在體外產生，不會在患者體內持續(xù)很久。

細胞衰老與增殖能力的喪失和功能缺陷有關，其特征是端�？s短、基因組DNA雙鏈斷裂的檢測、修復機制的激活以及細胞周期的停止。在參與NK細胞壽命控制的因素中，端粒長度至關重要。對于過繼性NK細胞治療，端粒長度取決于NK來源或選擇的活化／擴增方法。例如，iPSC衍生的NK細胞的端粒長度比從PB擴增的細胞長得多。此外，IL－2、IL－15和IL－21都已被證明能上調NK細胞中的端粒酶活性，從而防止端粒丟失并允許細胞延長復制。通過基因工程異位表達hTERT可能是提高CAR－NK細胞持續(xù)性的有效策略，從而提高其治療潛力，其中端粒長度和復制能力的維持與抗腫瘤效率相關。

腫瘤微環(huán)境：限制CAR－NK治療效果的絆腳石

NK細胞在腫瘤微環(huán)境中可被誘導為可逆的耗竭狀態(tài)，其特征是效應器功能受損、表型改變以及腫瘤相關免疫檢查點的表達上調。除此之外，患者的NK細胞和輸注的CAR－NK細胞在腫瘤生態(tài)位中還會受到免疫抑制細胞和可溶性細胞因子產生的不利環(huán)境，從而抑制NK細胞。

耗竭相關免疫檢查點

一些研究表明，擴增的NK細胞增加PD－1的表達，并且NK細胞產生的IFN－γ在肺癌小鼠模型中增加PD－L1的表達。目前正在研究將PD－L1 CAR－NK細胞與pembrolizumab和N－803聯(lián)合用于胃癌和頭頸癌的II期臨床試驗（NCT04847466）。

與NKG2A類似，NK細胞體外擴增可上調其他耗竭受體的表達，如TIM－3和TIGIT。在臨床前研究中阻斷TIM－3或TIGIT可提高NK細胞對實體和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的細胞毒性效力，目前正在多個臨床試驗中測試抑制性抗體（如NCT04623216、NCT03489343、NCT04150965、NCT04354246和NCT05289492）。此外，與T細胞不同，NK細胞中其他受體如LAG－3或CTLA－4的表達水平和抑制相關性仍不清楚。

總之，并非所有免疫檢查點在體外擴增的NK細胞中以相同的水平誘導，它們在調節(jié)NK細胞抗腫瘤活性方面也沒有類似的相關性。激活和抑制信號的平衡調節(jié)NK細胞功能，因此，需要更多的努力來評估存在CAR刺激時每個免疫檢查點表達的影響，以指導改善CAR－NK治療的策略。

TME中的其它抑制因素

來自TME的可溶性因子可能增強NK細胞抑制，如通過蛋白水解脫落產生的可溶性NKG2D－L（sNKG2D－1）會降低NKG2D的表達，減弱NK細胞的抗腫瘤效力。設計用于識別相同MICA／B結構域的CAR已在iPSC衍生的NK細胞中顯示出抗白血病的功效。

此外，大多數癌癥的TME中存在其它的可溶性因子，如白細胞介素、酶和代謝物，影響NK細胞的有效性。其中大部分不僅由腫瘤細胞釋放，而且由共存于腫瘤生態(tài)位中的免疫抑制細胞釋放。血液腫瘤中廣泛存在著高濃度的其他抑制性細胞因子，如IL－6、IL－10和TGF－β。已有研究通過在工程化NK細胞中敲低TGF－α受體表達或加入小分子受體激酶抑制劑來增強CAR－NK細胞治療。

除了可溶性因子，TME中還存在的免疫抑制細胞通過直接接觸或釋放可溶性因子促進腫瘤增殖，同時降低NK細胞功能。例如Treg、Breg、MDSC和腫瘤相關巨噬細胞（TAM），主要是M2表型。缺氧和代謝因素，如營養(yǎng)缺乏和酸度，也會產生不利的微環(huán)境，損害NK細胞的抗腫瘤活性。

趨化性：影響NK細胞的遷移和歸巢

CAR－NK免疫治療的挑戰(zhàn)之一在于到達BM和LNs的有限轉運和歸巢能力。臨床研究表明，改善過繼輸注NK細胞進入骨髓的情況與更好地控制AML患者的疾病有關。目前正在臨床前模型中探索維持和／或增強CAR－NK細胞中趨化因子或粘附受體表達的多種策略，以改善其遷移和歸巢。

CXCR4、CXCR3、CCR3、CCR5和CX3CR1是NK群體表達的主要趨化因子受體，它們有助于響應TME中存在的趨化因子。考慮到血液惡性腫瘤TME中發(fā)現的高水平趨化因子，對過繼轉移NK細胞中趨化因子受體的表達修飾似乎是一種有利的策略。UCB衍生NK細胞中CXCR4表達水平高于PB－NK細胞，表明BM歸巢能力更好。通過雙順反子慢病毒轉導修飾過表達CXCR4的CD19－CAR－NK細胞與huCAR19NK細胞相比，向CD19＋腫瘤細胞的遷移增加了兩倍以上。

除了調節(jié)趨化因子受體表達的策略外，還可以通過促進NK細胞與E－選擇素等粘附分子的相互作用來增強BM歸巢。例如，用人巖藻糖基轉移酶6（FUT6）和GDP巖藻糖處理NK－92MI細胞產生細胞表面E－選擇素配體sialyl Lewis X（sLeX），以改善向BM的遷移并增加對B淋巴瘤細胞的殺傷。

基因編輯：設計CAR－NK 2．0

基因編輯的應用為提高NK細胞的效率和持久性帶來了巨大希望。為此，不同的研究側重于識別負調節(jié)因子，其可通過增加細胞毒性、改善代謝和體內持久性，或通過克服抑制性免疫檢查點和TME觸發(fā)的功能耗竭機制，調節(jié)免疫功能并增強NK和CAR－NK效力。

提高CAR－NK持續(xù)性的主要策略之一是針對抑制性免疫檢查點，如PD－1／PD－L1軸，事實上，NK細胞中的PD－1敲除增加了卵巢癌異種移植模型中的抗腫瘤活性。TIM－3是NK細胞表達的另一個檢查點受體，TIM－3敲除的NK細胞在體外改善了細胞毒性。類似的基于CRISPR／Cas9的策略已應用于Siglec－7受體，當其與腫瘤細胞上表達的某些唾液酸化聚糖結合時，觸發(fā)NK抑制。

為了避免NK細胞耗竭，靶向細胞因子相關的免疫檢查點是另一種有趣的方法。包括細胞因子信號抑制劑（SOCS1–7和CIS）在內的幾種蛋白質通過NK細胞中的JAK／STAT途徑下調細胞因子信號，它們的中斷可增加NK細胞的活性和持續(xù)性。來自不同的研究表明，NK細胞中CISH的敲除增加了它們的細胞毒性特性，甚至改善了它們的代謝適應度。

CAR治療的最大挑戰(zhàn)之一，尤其是在實體瘤中，是腫瘤周圍產生的免疫抑制微環(huán)境。幾個研究小組已經成功地編輯了NK細胞，以破壞NK和CAR－NK細胞中的TGFβ－R2，這使得它們在體外對TGF－β抑制具有抗性，因此增強了對腫瘤的腫瘤控制。

消除CAR－NK細胞中的CAR靶向受體對于開發(fā)有效的免疫治療產品至關重要。例如，CD70在NK細胞中上調，導致自相殘殺。通過使用CRISPR／Cas9消除NK細胞中的CD70，獲得了抗自殺傾向的細胞，而不影響其細胞毒性效力。按照類似的策略，已經證明CD38－CAR－NK細胞中敲除CD38會導致自相殘殺導致的細胞死亡減少，并且CAR－NK細胞對AML原代細胞的細胞毒性反應更強。

最后，基因編輯可用于調節(jié)NK細胞遷移。已經表明，使用基因編輯破壞CCR5改變了體內NK細胞遷移，這減少了向肝臟的轉運并增加了BM歸巢。這種方法有望重新引導CAR－NK細胞，并提高其抗腫瘤的效力。類似的策略還可用于靶向CAR－NK表面的其他趨化因子受體，并將其重定向至腫瘤部位。

小結

NK細胞免疫生物學領域的進展和進步為更好和更新穎的免疫療法奠定了基礎，NK細胞優(yōu)秀的抗腫瘤作用使其成為細胞免疫治療的焦點。CAR－NK細胞療法是一個很有前途的臨床研究領域，與CAR－T細胞相比，CAR－NK細胞具有自己獨特的優(yōu)點，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括細胞的持久性，克服免疫抑制微環(huán)境，以及腫瘤歸巢等。相信解決好這些問題，基于NK細胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破。

參考文獻：

1．Overcoming tumor resistance mechanisms inCAR－NK cell therapy． Front Immunol．2022； 13： 953849．

       原文標題 : 在CAR-NK細胞治療中克服腫瘤耐藥機制