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前言

阿爾茨海默癥（AD）是一種進行性、不可逆的神經退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認知障礙、行為異常和社會缺陷。據預測，到2050年，美國65歲及以上老年癡呆癥患者的數(shù)量可能會達到1380萬。在中國，超過1507萬60歲或以上的老年人患有癡呆癥，其中約983萬人患有AD。

目前，AD的發(fā)病機制還不清楚。β－淀粉樣蛋白沉積和tau蛋白過度磷酸化被廣泛認為是AD發(fā)病的神經生物學機制。此外，其他年齡相關、保護性和疾病促進因素可能與AD的核心機制相互作用，并可能參與AD的發(fā)病。

近年來，CRISPR／Cas9的基因編輯技術發(fā)展迅速，在基礎研究和疾病治療領域顯示出巨大的潛力。最近，基因編輯技術被評估為AD研究和治療的一種有前途的方法。CRISPR／Cas9在AD模型構建、致病基因篩選和靶向治療等方面具有極大的應用潛力。

CRISPR／Cas9系統(tǒng)

CRISPR／Cas9系統(tǒng)本質上是一種針對外源DNA的細菌防御機制。CRISPR最初發(fā)現(xiàn)于20世紀80年代末，是一種由交替重復和非重復DNA序列組成的不尋常的遺傳結構�；�因組分析表明，CRISPR和Cas蛋白作為獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，并通過RNA引導的DNA切割系統(tǒng)保護原核DNA免受噬菌體和質粒DNA的攻擊。

當外源DNA侵入細菌時，其DNA片段作為間隔子并入CRISPR位點。然后將該位點轉錄到CRISPR前RNA（crRNA），該RNA附著到組成性形成的反式激活RNA（tracrRNA）上，由CRISPR相關蛋白修飾成gRNA。當gRNA與非活性Cas9復合物的REC I結構域結合時，該復合物被激活，導致gRNA及其互補單鏈DNA形成異源雙鏈。Cas9的HNH和RuvC核酸酶域隨后分別切割互補和非互補DNA鏈。

Cas9屬于1類CRISPR－Cas系統(tǒng)的II型，來源于化膿鏈球菌。Cas9與靶序列的偶聯(lián)需要一個原間隔基鄰近基序（PAM），一個小的入侵基因組中的3－8bp DNA序列，PAM在區(qū)分細菌自身和非自身DNA以及成功結合Cas9方面至關重要。

與ZFN和TALEN不同，ZFN和TALEN依賴于每個特定基因序列的精細蛋白質產物，CRISPR／Cas9系統(tǒng)依賴于gRNAs，使其成為更靈活的平臺。Cas9蛋白保持不變，而gRNA可以方便地根據每個基因進行定制。CRISPR／Cas9系統(tǒng)的另一個優(yōu)點是，它使得在多個基因座上同時進行基因編輯成為可能，與以前的系統(tǒng)相比，它提供了一個更高效和可擴展的平臺。

CRISPR／Cas9應用于AD模型的構建

細胞模型由于不涉及倫理問題，實驗周期相對短，成本低，因此在包括AD在內的各種神經疾病的研究中得到了廣泛的應用。在過去的幾十年中，建立了許多AD的體外細胞模型。迄今為止，AD研究中常用的細胞系包括人類神經母細胞瘤細胞SH－SY5Y和SK－N－SH、小鼠海馬神經元細胞系HT22和膠質細胞BV2以及小鼠膠質母細胞瘤細胞N2a。CRISPR／Cas9基因編輯技術的出現(xiàn)可以促進更有效地開發(fā)AD細胞模型。

例如，通過CRISPR／Cas9系統(tǒng)下調HT22細胞中硫氧還蛋白相互作用蛋白（Txnip）水平可有效減弱β－淀粉樣蛋白誘導的蛋白質半胱氨酸氧化修飾。研究結果表明，Txnip可能是治療AD的一個治療靶點。

除了構建AD細胞模型外，CRISPR／Cas9技術還可用于構建AD動物模型。2020年，Serneels等人通過使用CRISPR／Cas9策略在小鼠和大鼠的APP基因中生成人源化aβ序列（G676R、F681Y和R684H），創(chuàng)建了一個名為Apphu／hu的新模型。通過在嚙齒類動物Aβ序列中插入三種氨基酸，Aβ的水平比原始野生型菌株增加了三倍以上。

CRISPR／Cas9應用于AD致病基因的篩選

阿爾茨海默癥分為散發(fā)性（SAD）和家族性（FAD）。APP、PSEN1和PSEN2是引起FAD的主要致病基因，每個基因的突變都可能導致FAD的發(fā)生。然而，95％以上的AD病例是散發(fā)性的，SAD致病基因的篩選對于了解AD的分子發(fā)病機制、早期診斷、風險預測和治療至關重要。

高通量測序和CRISPR／Cas9的發(fā)展為SAD致病基因的篩選提供了很大的幫助。例如，研究發(fā)現(xiàn)，通過CRISPR系統(tǒng)敲除IPSC中的TREM2，小膠質細胞的存活、載脂蛋白E的清除和SDF－1α／CXCR4介導的趨化性都受到嚴重影響，最終導致對β淀粉樣斑塊的損傷反應。此外，Duan等人設計了基于成像的陣列CRISPR，用于研究與AD特征相關的基因。這也將提供一個探索AD生物學的平臺和藥物發(fā)現(xiàn)的機會。

CRISPR／Cas9應用于AD的靶向治療

CRISPR／Cas9靶向APP基因突變

APP基因的突變導致Aβ前體蛋白的β－分泌酶切割增加，從而導致顯性遺傳性AD。Gyorgy等人報告，當使用CRISPR／Cas9技術敲除APP等位基因時，Aβ蛋白的表達降低。因此，CRISPR／Cas9系統(tǒng)可能為具有APP突變的AD患者提供基因治療策略。

CRISPR／Cas9靶向Aβ蛋白的關鍵酶

Aβ蛋白是通過BACE1和γ－分泌酶對APP進行順序修飾形成的。因此，靶向BACE1和γ－分泌酶是治療AD的一種潛在治療策略。Park等人報告，在兩種AD小鼠模型中，通過使用CRISPR／Cas9成功降低了BACE1的表達。γ－分泌酶由γ－分泌酶激活蛋白（GSAP）調節(jié)，Wong等人利用CRISPR－Cas9技術在穩(wěn)定表達APP的HEK293細胞中敲除GSAP，導致Aβ分泌和γ－分泌酶活性顯著降低。

CRISPR／Cas9靶向編輯載脂蛋白E基因型

APOE4亞型是SAD最強的遺傳風險因素。眾所周知，APOE主要由中樞神經系統(tǒng)的星形膠質細胞表達。Wadhwani等人關于APOE4治療靶點的研究表明，當通過CRISPR／Cas9方法將兩名AD患者的IPSC中的E4等位基因更正為E3／E3基因型時，E3神經元對離子霉素誘導的細胞毒性不太敏感，并且表現(xiàn)出tau磷酸化的降低。此外，Lin等人利用hiPSC和CRISPR／Cas9技術鑒定了APOE4的功能，他們的結果表明APOE4以不同的方式影響Aβ代謝。這些發(fā)現(xiàn)表明APOE4可能是治療AD的一個有希望的靶點。

CRISPR／Cas9靶向促炎分子

人類基因關聯(lián)研究表明，免疫反應也是AD病因的主要途徑。越來越多的證據表明慢性神經炎癥在AD中的重要性。CD33是一種免疫調節(jié)受體，在中性粒細胞上高水平表達，在小膠質細胞上低水平表達，在調節(jié)AD病理學的吞噬功能方面具有不同的作用。Bhattacherjee等人的最新研究表明，通過CRISPR／Cas破壞CD33基因，并替換為hCD33的保護性變體，可以減輕Aβ病理和神經退行性變。

膠質成熟因子（GMF）是一種新發(fā)現(xiàn)的促炎癥分子，主要在淀粉樣斑塊周圍的反應性膠質細胞中表達，并在各種AD腦區(qū)高度表達。GMF的過度表達通常通過激活p38 MAPK信號通路和氧化毒性導致神經細胞死亡。Raikwar等人通過CRISPR／Cas9方法成功降低BV2細胞中的GMF表達，從而抑制pp38 MAPK以調節(jié)GMF誘導的小膠質細胞促炎癥反應。

半胱氨酸白三烯（Cys－LTs）是一組炎癥脂質分子，通過兩種主要的G蛋白偶聯(lián)受體（CysLT1R和CysLT2R）啟動炎癥信號級聯(lián)反應。近年來，越來越多的證據表明CysLT1R與AD的發(fā)生和發(fā)展密切相關，并可通過NF－κB途徑介導炎癥反應。Chen等人證明，通過CRISPR／Cas9系統(tǒng)刪除CysLT1R可減少APP／PS1小鼠的淀粉樣病變并減輕神經炎癥。

小結

基因編輯由于其在科學研究和疾病治療中廣泛而有效的應用前景，近年來進入了一個蓬勃發(fā)展的時期。最近，已有許多關于CRISPR／Cas9介導的AD相關研究，主要涉及利用該技術構建AD模型、篩選致病基因以及通過特定靶基因（如APP、BACE1、APOE4、CD33、GMF和CysLT1R）治療AD。然而，考慮到該技術中潛在的非靶向錯配和特異性組織靶向性，CRISPR－Cas9最終應用于AD的臨床治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

總之，CRISPR／Cas9作為本世紀的基因編輯技術的突破性進展，為臨床基因治療開辟了新的途徑。與其他基因編輯技術相比，CRISPR－Cas9系統(tǒng)具有周期短、細胞毒性低、價格低廉、傳遞簡單等優(yōu)點。因此，盡管考慮到仍存在一些缺點，CRISPR－Cas9系統(tǒng)在AD的臨床治療中仍具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

1． Application of CRISPR／Cas9 in Alzheimer’sDisease． Front Neurosci． 2021； 15： 803894．

       原文標題 : CRISPR/Cas9在阿爾茨海默癥中的應用前景