TCR－T細胞療法的工作流程

為了分離治療性TCR，必須首先從患者或健康獻血者的血液中分離抗原特異性T細胞，并在體外用特異性肽抗原以及細胞因子（如IL－2和IL－15）進行擴增。這一過程需要事先確定可安全靶向于患者的特定腫瘤相關肽靶點。在選擇了靶抗原后，可以使用不同的方法來篩選具有所需的高親和力和腫瘤特異性的TCR。臨床前安全性測試對于確保分離的高親和力TCR的最小靶外效應和交叉反應性也是必要的。病毒載體通常用于對自體患者T細胞進行基因修飾，以表達經驗證的治療性TCR，然后再輸回患者體內。

確定靶抗原

T細胞識別的黑色素瘤抗原1（MART－1）是TCR－T臨床試驗中第一個靶向的腫瘤相關抗原。在這一突破之后，針對多種腫瘤抗原的TCR－T療法已經開發(fā)出來，包括針對MAGE－A3、MAGE－A4、GD2、間皮素、gp100、MART1、AFP、CEA、NY－ESO－1以及源自HPV和EBV的病毒肽的TCR－T療法。其中，NY－ESO－1已被證明是TCR－T細胞最有希望的靶點之一，在治療滑膜肉瘤方面取得了成功，客觀有效率為67％。

理想的TCR－T靶抗原顯示以下特征：（1）誘導免疫反應的能力；（2）與驅動腫瘤表型（如癌基因）相關，以降低抗原丟失和腫瘤免疫逃避的風險；以及（3）在腫瘤干細胞上的表達以促進永久性腫瘤根除。

腫瘤相關抗原的鑒定方法

高分辨率質譜（MS）已被證明是促進從腫瘤細胞直接識別HLA－I結合肽的最強大的高通量方法。在這種方法中，通過免疫沉淀（IP）從腫瘤組織或細胞系中分離HLA－I／肽復合物，然后充分洗滌并應用酸性洗脫緩沖液，從HLA－I分子和用于IP的抗體中分離結合肽抗原。該策略允許每個腫瘤樣本識別數(shù)千個經驗證的肽靶點，并已用于識別膠質母細胞瘤（GB）、黑色素瘤、腎細胞癌（RCC）和結直腸癌（CRC）等的HLA－I配體。

腫瘤新抗原的鑒定方法

盡管基于MS的技術可用于識別新抗原，但由于其相對較低的豐度以及MS的有限靈敏度，尤其是對于大小有限的腫瘤樣本，它們更難識別。然而，新一代測序技術的發(fā)展有助于識別和定位這類腫瘤靶點。全外顯子組DNA測序，結合計算預測算法，允許識別癌細胞中的特定遺傳改變，這些改變可以產生突變肽，并能夠呈現(xiàn)在腫瘤HLA－I分子上。

所有體細胞突變基因都可以進行電腦分析，以預測可能與患者個體HLA－I分子結合的潛在高親和力表位，從而被T細胞識別。隨著大型MS洗脫肽數(shù)據庫的使用，HLA－I肽結合預測算法不斷更新和改進，其他預測算法試圖考慮與細胞內過程復雜性相關的生物變量。

另一個經常使用的方法是腫瘤RNA測序，它允許選擇具有最高轉錄表達的新抗原。值得注意的是，盡管這些預測方法在識別呈遞的和高免疫原性新抗原時通常表現(xiàn)出非常好的準確性，但它們通常預測的新抗原靶點的數(shù)量比真實靶點的實際數(shù)量高1到2個數(shù)量級。

通過trogocytosis發(fā)現(xiàn)新抗原是近年來出現(xiàn)的一種新方法。Trogocytosis是細胞結合過程中發(fā)生的一種生物學現(xiàn)象，在此過程中，細胞共享并轉移膜和膜相關蛋白。Li等人發(fā)現(xiàn)T細胞膜蛋白特異性轉移到腫瘤靶細胞，這些靶細胞呈遞同源HLA－I／肽復合物。利用這些T細胞－靶細胞相互作用，他們通過將表達標記孤兒TCR的T細胞與同源靶細胞共同孵育，創(chuàng)建了新抗原發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)。通過將熒光標記從T細胞轉移到靶細胞，該方法能夠分離這些靶細胞并對同源TCR配體進行測序，從而建立新抗原文庫。

分離腫瘤特異性T細胞和TCR

使用HLA－I多聚體、單細胞TCR測序或抗原陰性的人源化小鼠，腫瘤反應性T細胞和TCR可從自體、異體或異種細胞庫中識別鑒定。

利用HLA－I多聚體法，可通過多聚體染色和流式細胞術分選直接分離抗原特異性CD8＋T細胞。在分離成對的全長TCR序列之前，對這些多克隆T細胞進行同源肽識別和抗腫瘤功能測試。采用高靈敏度的基于PCR的單細胞TCR分析方法（TCR－SCAN），可以得到具有高親和力和特異性的TCR。

另外一種方法利用了人源化小鼠TCR基因庫，該基因庫不會發(fā)生在人類中產生的T細胞克隆缺失或耐受。為此，Li等人利用整個人類TCRα／β基因位點和嵌合HLA－A2轉基因構建了轉基因小鼠，以實現(xiàn)針對人類TAA的人類TCR的分離。

單細胞測序方法代表了高通量分離腫瘤特異性TCR編碼基因的更有前景的方法。使用靶向TCRα和TCRβ基因座內每個單獨V和J元件的RNA誘餌文庫，可以從剪切的基因組DNA（gDNA）片段中選擇性分離TCR編碼基因組元件，用于隨后的配對末端深度測序。這使得從人類材料或TCR人源化小鼠的寡克隆T細胞群中鑒定抗原特異性TCR成為可能。

幼稚T細胞也可以作為TCR－T治療的TCR來源。TAA和新抗原特異性T細胞可從癌癥患者外周血中的低頻前體中衍生和擴增，并可重新輸注或用作抗原特異性TCR的來源。由于癌癥患者通常表現(xiàn)出免疫抑制或顯性T細胞耐受，HLA－I匹配的健康供體的原始序列也代表了一個可靠的來源，因為它具有巨大的多樣性TCR序列，理論上T細胞具有任何抗原特異性，包括腫瘤新抗原。已經開發(fā)了高通量技術平臺，用于尋找原始的序列，以便快速有效地識別用于個性化過繼性T細胞治療的罕見但有治療價值的TCR。

TCR的克隆

大多數(shù)基于TCR的基因治療方法依賴于用病毒載體對T細胞進行體外轉導，最早用于基因治療的載體是腺病毒。然而，由于它們不能將轉基因整合到宿主基因組中，TCR表達在T細胞增殖過程中會丟失。此外，腺病毒的免疫遺傳特性也限制了其作為基因治療載體的應用。相比之下，逆轉錄病毒作為基因轉移載體表現(xiàn)出更大的前景，因為它們可以感染多種細胞，并有能力將轉基因插入宿主基因組，從而使異位TCRα／β鏈穩(wěn)定表達。

由γ－逆轉錄病毒如小鼠白血病病毒（MLV）衍生的逆轉錄病毒載體已被廣泛用于基因轉移到人類T細胞中。這種方法已被用于傳遞各種基因，包括自殺基因、TCR和CARs。主要缺點是它們不能轉導非增殖性靶細胞，這就排除了靜止的T細胞在TCR－T治療中的應用。此外，逆轉錄病毒插入突變可能引起潛在的副作用。

最近，慢病毒載體（LV）作為基因轉移載體獲得了更多的關注，因為它們可以將基因傳遞到分裂和非分裂細胞中。各種技術，如Golden Gate克隆和LR克隆，通常用于構建插入TCRα／β基因的載體。

腺相關病毒（AAV）是另一種廣泛使用的病毒載體。與腺病毒載體相比，AAV具有較低的免疫原性和更廣泛的細胞向性，因此在腫瘤基因治療中得到了廣泛的應用。為了促進轉基因整合，人們開發(fā)了自互補AAV載體（scAAV），使AAV獨立于宿主細胞的互補鏈合成，scAAV在臨床前模型中的療效優(yōu)于傳統(tǒng)AAV。

同時，一些非病毒基因編輯方法也被開發(fā)出來。mRNA電穿孔已被證明可實現(xiàn)短暫的TCR和CAR表達，從而將病毒成分持續(xù)存在的風險降至最低。臨床數(shù)據表明，mRNA修飾的TCR－T和CAR T細胞都是可行和安全的，沒有明顯的證據表明對正常組織有非靶向毒性。然而，缺乏持續(xù)的TCR表達可能會限制療效，需要反復輸注。此外，非病毒性睡美人反轉錄轉座子系統(tǒng)也被用于TCR和CARs的轉導。

基因編輯通過同源定向修復（HDR）可以將大基因片段特異、高效地插入靶細胞。使用CRISPR／CAS9開發(fā)的TCR－T細胞已被證明在體外特異性識別腫瘤抗原，并在體內誘導產生性抗腫瘤反應。

TCR的驗證方法

在TCR克隆后，需要進行廣泛的臨床前驗證，以證明工程化TCR－T細胞的特異性和安全性。驗證包括通過滴定同源肽抗原來評估TCR的親和力，以及測量一組對HLA－I匹配的腫瘤細胞系的殺傷作用。如果沒有這樣的腫瘤細胞系存在，靶細胞可以轉導表達相關抗原和相關的HLA－I分子。新抗原也可以在自體抗原呈遞細胞中表達，以評估TCR的抗原反應性。

安全性測試包括測試候選TCR－T對HLA－I匹配原發(fā)組織的識別能力，以確保沒有正常組織作為靶點，產生可能導致的非靶向毒性。在至少兩次TCR－T細胞治療臨床試驗中，發(fā)生過對正常腦細胞和心臟細胞的交叉反應，從而導致患者死亡。這些試驗結果強調了TCR進入臨床試驗前進行廣泛安全性試驗的重要性。

TCR－T的安全性

TCR－T細胞的ACT顯示出很高的腫瘤殺傷，但在一些臨床研究中也出現(xiàn)了一些嚴重的不良事件。優(yōu)化工程化T細胞中的TCR親和力至關重要，受體親和力能夠決定T細胞治療的安全性和有效性。就療效而言，親和力TCR相互作用足以激活T細胞，但需要強親和力來維持T細胞的擴增。

在I／II期ACT臨床試驗中，低親和力工程化T細胞顯示出更安全的特性，但它們的抗腫瘤反應較弱。通過識別T細胞的TCR－pMHC相互作用，可以將工程化T細胞分為高親和力型和低親和力型。此外，人們也開發(fā)了一些技術來提高TCR－T的安全性。

基于工程化T細胞的安全開關機制是一種有吸引力的策略。來源于單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV－TK）的胸苷激酶基因是最常見的自殺基因之一。

盡管HSV－TK在基于細胞的免疫治療中顯示出安全性，但需要導入磷酸化的核苷類似物。另一個更安全的誘導T細胞安全開關稱為誘導型caspase－9（iC9）。iC9是一種修飾的人FK結合蛋白，可通過小分子化合物AP1903激活，這一過程依賴于線粒體凋亡途徑。

iC9自殺基因的免疫原性較低，引發(fā)針對轉基因細胞的免疫反應降低�；�于iC9的安全開關已經被證明比先前的自殺基因更有潛力用于細胞治療。

TCR－T細胞治療的臨床現(xiàn)狀

截止2021年8月9日，在ClinicalTrials上共有175項使用TCR－T療法的研究正在進行中，其中71項是針對特定TAA或新抗原的特異性TCR，有32項研究已經完成。NY－ESO－1是最常見的靶向抗原，在多種癌癥中均有表達，包括骨髓瘤、黑色素瘤等。其他腫瘤睪丸相關抗原，如PRAME和MAGE蛋白，以及黑色素瘤分化抗原MART－1和gp100，以及最近的癌癥驅動因子，如WT1、KRAS和TP53，也是流行的TCR－T靶點。                    

共有83名贊助者／合作者發(fā)起或參與TCR－T細胞治療的研究，包括美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）、政府組織、行業(yè)和大學／學術機構。目前，美國國家癌癥研究所（NCI）共支持了53個TCR－T項目，占到了所有正在進行項目的20％。

在開發(fā)TCR－T療法的29家制藥公司中，葛蘭素史克和Adaptimunime發(fā)起了最多的臨床試驗，分別為11項和7項。最近，報道了一項針對人乳頭瘤病毒（HPV）－16 E7蛋白的TCR－T細胞治療轉移性人乳頭瘤病毒相關上皮癌的1期臨床試驗（NCT02858310）。在這項研究中，12名接受治療的患者中有6名出現(xiàn)了客觀的臨床反應，觀察到了穩(wěn)健的腫瘤消退。這是TCR－T細胞療法的一個里程碑式的臨床試驗，證明靶向病毒抗原對病毒相關癌癥患者具有良好的臨床效果。其他被探索為TCR靶點的病毒抗原包括HPV－E6蛋白、來自EB病毒（EBV）的抗原和人類內源性逆轉錄病毒（HERV）靶點，如HERV－E。

靶向TAAs 的MART－1和NY－ESO－1 TCR－T療法在晚期黑色素瘤、骨髓瘤和非小細胞肺癌中也顯示出臨床療效。完成的TCR－T臨床試驗的總有效率（ORR）在0～60％之間。值得注意的是，這些TCR－T臨床試驗中的大多數(shù)都只入組了少量患者（2至25名），因此ORR在統(tǒng)計上可能不太準確。因此，需要更大規(guī)模的II期和III期臨床試驗來確認這些TCR－T療法的實際臨床療效。